肝郁脾虛證胃潰瘍大鼠的尿液代謝組學(xué)研究*

余王琴 鄭小偉 杜仲燕

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

胃潰瘍（GU）是消化系統(tǒng)最常見的疾病之一，因起病隱匿及不積極治療等因素，常引起出血、穿孔及癌變等嚴(yán)重后果[1]。胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”范疇，肝郁脾虛為其主要病機(jī)。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法之一，且其整體研究思路與中醫(yī)藥的整體論與系統(tǒng)觀不謀而合，這有助于揭示中醫(yī)藥復(fù)雜作用機(jī)制[2-3]。本次研究運(yùn)用基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法分析胃潰瘍肝郁脾虛證的可能生物學(xué)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物：清潔級(jí)SD雄性大鼠32只，體重160±20g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)、恒溫飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器：甲酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Tedia公司)，1260 infinity高效液相色譜儀，Eclipse Plus C18色譜柱(2.1×50.0mm，1.8μm)，Agilent 6520 Q-TOF/MS質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-Q Biocel純水儀（美國(guó)Millipore公司）；SIMCA-P(瑞典Umetrics公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，按照隨機(jī)數(shù)據(jù)表將32只大鼠分為正常對(duì)照組、胃潰瘍肝郁脾虛證模型組各16只。

2.2 造模：采用多因素復(fù)合模擬中醫(yī)病因結(jié)合乙酸燒灼法[4]復(fù)制胃潰瘍肝郁脾虛證模型，隨機(jī)取正常組與胃潰瘍肝郁脾虛證模型組大鼠各8只模型驗(yàn)證。

2.3 樣品采集與處理：模型驗(yàn)證成功后，采用代謝籠收集兩組大鼠24h尿液，保存于-80℃冰箱備用。室溫下解凍尿液樣品，取200μl尿樣置于離心管中，加入600μl雙蒸水，渦旋，低溫高速離心。取上清液過0.22μm尼龍微孔濾膜，進(jìn)樣液相質(zhì)譜分析。質(zhì)量控制：從4組實(shí)驗(yàn)樣本中抽取等量的尿液混合，制得質(zhì)量控制樣品，處理同樣品處理。在采集數(shù)據(jù)之前，使用質(zhì)控品進(jìn)樣，每采集8個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行1次質(zhì)量控制品的分析。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化：色譜柱為Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%乙腈。樣品采用梯度洗脫，在22min內(nèi)從起始5%B增加至95%B，后運(yùn)行時(shí)間設(shè)定為3min；流速設(shè)定為0.1mL·min-1；進(jìn)樣量為4μL。質(zhì)譜主要參數(shù)為：質(zhì)荷比的采集范圍為50～1000m/z，干燥氣N2流速為10L/min，霧化氣壓力為3.1bar，毛細(xì)管電壓設(shè)定為4000V，溶劑化離子去簇電壓為150V，錐孔電壓為60V。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用Centroid模式保存質(zhì)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集速率為2spectrum/s。

2.5 數(shù)據(jù)處理：采用Mass Hunter軟件處理獲得的尿樣圖譜代謝物信息，利用Mass Profiler Professional（MPP）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，再行主成分分析(PCA)與偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。得到得分圖和載荷圖。利用SIMCA-P驗(yàn)證MPP分析結(jié)果，再根據(jù)精確的分子質(zhì)量數(shù)在METLIN、KEGG、Massbank和HMDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索比較，鑒定潛在標(biāo)記物，分析代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察：正常組大鼠精神良好，動(dòng)作靈活自如，毛發(fā)光潔，攝食正常，體肌強(qiáng)健。造模大鼠易激惹，攝食減少，便質(zhì)稀軟、味重，毛發(fā)疏散不潔或豎起，成群蜷臥。

3.2 兩組尿液樣品的LC-MS分析及總離子流圖（TIC）：利用ESI離子模式分別采集尿液樣本數(shù)據(jù)，得到兩組尿液代謝物典型的總離子流圖（圖1）。

圖1 典型的總離子流圖

3.3 正常組與模型組模式識(shí)別結(jié)果：見圖2。由圖可知，胃潰瘍肝郁脾虛證模型組和對(duì)照組明顯的分離，說明兩組大鼠尿液中代謝物種類或者數(shù)量上存在一定差異。

圖2 PCA、PLS-DA得分圖與PLS-DA載荷圖

3.4 差異代謝物的鑒定：根據(jù)差異代謝物的精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜圖，鑒定差異代謝物。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和質(zhì)譜圖驗(yàn)證，使用精確分子量數(shù)據(jù)檢索，再通過負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜碎裂方式推測(cè)代謝物結(jié)構(gòu)，最后通過METLIN數(shù)據(jù)庫MS/MS譜圖對(duì)比的方法鑒別，9種代謝標(biāo)記物得到鑒定，鑒別結(jié)果如表1所示。

表1 差異代謝物鑒別結(jié)果

4 討論

苯甲酸（Toluate）在肝臟和甘氨酸結(jié)合成馬尿酸。有研究[5]顯示馬尿酸可正確反映肝臟的能量代謝情況。甘氨酸為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，武雯等[6]研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸具有減輕炎癥反應(yīng)、降低內(nèi)毒素作用，可通過拮抗內(nèi)毒素起到保護(hù)胃腸免疫屏障的作用。精氨酸是體內(nèi)合成一氧化氮(NO)的前體，NO主要通過影響壁細(xì)胞、粘液細(xì)胞、主細(xì)胞及其它胃腸上皮細(xì)胞的功能，來調(diào)控黏膜損害因子或保護(hù)因子的分泌如胃蛋白酶、胃酸、粘液等。Amino-5-oxohexanoate是賴氨酸的代謝產(chǎn)物，過高濃度的賴氨酸能引起高胃蛋白酶水平，不利于胃黏膜修復(fù)。4-羥基谷氨酸（4-hydroxy-glutamate）與谷氨酸可轉(zhuǎn)化，谷氨酸是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)[7]。Glu系統(tǒng)可能參與情感障礙發(fā)病過程，抑制谷氨酸受體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或降低谷氨酸活性的藥物具抗躁狂功效[8]。2-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propenoic acid參與了酪氨酸的代謝。腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺等物質(zhì)是酪氨酸轉(zhuǎn)換而來的，發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸功能的作用。(3R)-3-isopropenyl-6-oxoheptanoic acid為庚酸，Tumonoic Acid F為酮酸。2,6dimethylheptanoyl carnitine為酰基肉堿。酰基肉堿是L-肉堿生成的，L-肉堿在哺乳動(dòng)物的能量和脂肪代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)胃潰瘍肝郁脾虛證模型大鼠發(fā)病過程中伴隨著能量代謝、脂肪酸、氨基酸物質(zhì)代謝障礙與神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂。