負壓封閉引流治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠的效果

劉洋　白曉智　李小強　陳子閱　何亭

[摘要] 目的 探討負壓封閉引流（VSD）治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠的效果。 方法 選取雄性C57BL/6J小鼠300只，建立燒傷膿毒癥小鼠模型；取造模成功的80只燒傷膿毒癥小鼠按照隨機數字表法將其分為實驗組和對照組，每組各40只。實驗組創面處理并采用VSD治療，接負壓治療儀，調節負壓為-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；對照組僅創面處理，每隔24 h更換敷料一次。統計兩組創面細菌熒光強度，創面皮膚血流量情況，白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子水平，觀察7 d累計生存率。 結果 治療前，兩組的創面熒光強度相似，差異無統計學意義（P > 0.05）；與治療前比較，治療24 h后對照組熒光信號強度顯著升高（P < 0.05），實驗組熒光強度降低（P < 0.05），且兩組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。與治療前比較，對照組經治療第1、2天有所降低，第3、5、7天后陸續升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；實驗組治療第1、2、3、5、7天小鼠背部創面血流量逐漸增加且明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。經治療，實驗組促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加，差異均有統計學意義（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05）。從第2天開始，實驗組生存率明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。 結論 VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，可降低創面細菌含量，改善血液供應，降低膿毒癥的全身炎性反應水平，提高生存率。

[關鍵詞] 負壓封閉引流；燒傷膿毒癥；C57BL/6J小鼠；炎性反應

[中圖分類號] R644 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of vaccum sealing drainage （VSD） on C57BL/6J mice with burn sepsis. Methods A total of 300 male C57BL/6J mice were used to establish the model of burn sepsis. Eighty burned sepsis mice successfully were divided into experimental group and control group according to random number table， 40 mice in each group. In the experimental group， the wound was disposed and treated with VSD， the negative pressure apparatus was connected， and the negative pressure was adjusted to -120 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）. In the control group， only wound treatment was performed， and dressing was replaced every 24 h. The fluorescence intensity and blood flow of wound skin， the levels of inflammatory cytokines such as IL-1β， IL-6， IL-8， IL-10， TNF-α and so on were statistically calculated in the two groups， and the cumulative survival rate of 7 d was observed. Results Before treatment， the fluorescence intensity of wound was similar between the two groups， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with before treatment， the fluorescence intensity of the control group increased significantly after 24 h of treatment （P < 0.05）， while the fluorescence intensity of the experimental group decreased compared with before treatment （P < 0.05）. The difference between the two groups was statistically significant （P < 0.05）. Compared with before treatment， the control group showed a decrease on the 1st and 2nd day after treatment， and an increase on the 3rd， 5th and 7th day after treatment， there were statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The blood flow to the wounds on the back of the experimental group gradually increased and were significantly higher than those of the control group after treatment （P < 0.05 or P < 0.01）. In the experimental group， the contents of pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly reduced and IL-8 was significantly increased compared with the control group （all P < 0.05）， while the changes of IL-10 were not significant （all P > 0.05）. From day 2， the survival rates of the experimental group were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Conclusion VSD treatment for C57BL/6J mice with burn sepsis can reduce bacteria content of wounds， improve blood supply， reduce systemic inflammatory response level of sepsis and improve survival rate.

[Key words] Vaccum sealing drainage； Burn sepsis； C57BL/6J mice； Inflammatory response

據統計[1-2]，全世界每年有超過1800萬嚴重膿毒癥病例，且每年以大于1.5%的速度遞增，而重度燒傷是膿毒癥最常見的發病原因之一。盡管現代重癥救治的技術水平在不斷發展進步，但目前燒傷膿毒癥仍是重度燒傷患者后期死亡的主要原因之一，也是臨床燒傷治療的瓶頸與難題。因此，有效預防和治療燒傷膿毒癥一直是國內外燒傷領域研究的熱點。

負壓封閉引流（vaccum sealing drainage，VSD）技術是近年來興起的一種促進創面愈合的前沿技術，是將創面用聚乙烯醇材料覆蓋并用半透膜封閉，最后與中心負壓或負壓泵連接使創面保持相對的負壓封閉環境，通過引流管將創面中組織間隙中的滲出液排出體外。VSD能減輕局部組織水腫，增加創傷周圍血液流量，清除創面細菌，促進肉芽組織形成并加速創面愈合[3-6]，可用于燒傷創面感染的早期治療。即使應用VSD治療，臨床上仍有一些燒傷膿毒癥患者發展為難以控制的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最終導致患者死亡。燒傷膿毒癥的全身炎性反應問題是亟待解決的重大科學問題。本研究采用VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，觀察其細菌量、血流及炎癥因子的變化，統計其生存率，以期為提高燒傷膿毒癥的治療效果、探討其作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8～12周齡的SPF雄性C57BL/6J小鼠300只[空軍軍醫大學西京醫院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2016，合格證號：20160809]，體重18～20 g。飼養在20～25℃室溫，濕度50%的環境中，自由飲食，適應性飼養1周后用于后續實驗。本研究經陜西省實驗動物倫理委員會審批同意。

1.2 方法

1.2.1 燒傷膿毒癥小鼠模型的建立 腹腔注射1%苯巴比妥鈉1 mL，麻醉成功后，固定小鼠，剪除待建模區域毛發，再用10%硫化鈉脫去殘余毛發，直至背部皮膚完全暴露。在小鼠背部脫毛區正中部位，以脊柱為中線，放置1個內徑2 cm的圓柱狀鋼化模具，用鉗夾固定圓柱狀模型于小鼠背部，熨燙蒸汽機開機，溫度調至100℃，將模具與小鼠背部皮膚緊密貼合后，將蒸汽噴頭放入燙傷模具，蒸汽噴頭與皮膚保持1 cm的距離，溫度95～98℃，持續燙傷5 s，即可形成1個直徑2 cm的Ⅲ度燙傷圓形創面，通過局部創面注射野生型銅綠假單胞菌（ATCC27853），即建立燒傷膿毒癥小鼠模型。12 h后檢測小鼠的創面、各臟器，均存在細菌即為造模成功。300只實驗動物最終成功制備80只燒傷膿毒癥模型，余下均因燒傷后感染死亡。

1.2.2 治療方法 造模結束24 h后，再次對小鼠行麻醉，待麻醉成功后，消毒術區后，切除小鼠燙傷部位的壞死痂皮，并用1%過氧化氫溶液、0.2%呋喃西林和無菌生理鹽水依次蘸洗創面；完成對模型小鼠的切痂處理后，將80只燒傷膿毒癥小鼠按照隨機數字表法將其分為實驗組和對照組，每組各40只。其中實驗組將按創面形狀剪裁好的醫用聚氨酯泡沫（施樂輝醫用產品公司），覆蓋在創面上方，將剪有側孔的一次性醫用引流管的一端置入聚氨酯泡沫中，用生物半透膜（施樂輝醫用產品公司）將聚氨酯泡沫和創面一起封閉，然后接負壓治療儀（施樂輝醫用產品公司），調節負壓為-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）持續負壓吸引；對照組按創面形狀剪裁醫用聚氨酯泡沫敷料覆蓋創面后，用生物半透膜封閉創面，每隔24 h更換敷料一次。兩組小鼠均單籠飼養并觀察。

1.3 觀察指標

1.3.1 創面細菌熒光強度檢測 分別于實驗24 h后，用IVIS 2000小動物活體成像系統（Caliper Life Science公司，美國）檢測模型動物創面標記菌的熒光強度，以反映小鼠創面銅綠假單胞菌定殖情況，強度越強，提示燒傷創面銅綠假單胞菌含量越高。

1.3.2 背部創面皮膚血流量情況 采用PeriFlux 5000多普勒血流成像儀（Perimed公司，瑞士）于實驗第0、1、2、3、5、7 天檢測小鼠背部創面血流情況。

1.3.3 白介素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子檢測 于實驗第0、1、2、3、5、7天收集創面滲出液，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等炎性細胞因子，按照試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司）說明書操作。

1.3.4 生存分析 觀察各組7 d累計生存率，并進行生存分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，重復測量的數據采用方差分析，兩組間比較采用t檢，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組燒傷創面的熒光強度

治療前，兩組的創面熒光強度相似，差異無統計學意義（P > 0.05）；治療24 h后，對照組熒光信號強度顯著升高（P < 0.05），實驗組熒光強度降低（P < 0.05），兩組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組背部創面血流量的變化情況

與治療前比較，對照組經治療第1、2天后背部創面血流量有所降低，第3、5、7天后陸續升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；實驗組經治療第1、2、3、5、7天后，小鼠背部創面血流量逐漸增加且明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 兩組外周血中炎性細胞因子水平

ELISA檢測結果顯示，實驗組經VSD治療后炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加，差異均有統計學意義（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05）。見圖1。

2.4 兩組燒傷膿毒癥小鼠生存率

自第2天開始，實驗組生存率明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見圖2。

3 討論

VSD具有創面封閉和免疫調控作用，是近年來興起的一種促進創面愈合的前沿技術。該技術在創面治療中的作用已得到臨床廣泛認可。VSD可在創面局部形成持續負壓，并在負壓敷料和組織細胞之間產生機械應力作用于細胞，其中最重要的一種是細胞表面形成的剪切力，這種力的作用不僅有助于清除創面壞死組織，而且能促進肉芽組織生長及血管生成[7-9]。大量研究[10-11]表明，這種機械應力對內皮細胞形態、功能以及基因表達均有調節作用，更為重要的是可促使單核細胞、成纖維細胞等的增生和趨化。本研究采用VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，實驗組的熒光信號強度較對照組顯著降低（P < 0.05），提示VSD可以有效縮小燒傷感染創面面積，降低創面細菌含量。實驗組經治療第1、2、3、5、7天后小鼠背部創面血流量逐漸增加且明顯高于對照組（P < 0.05或P < 0.01），提示實驗組小鼠創面及創周血液供應良好，可能與VSD治療能夠清除創面代謝廢物，提供營養、氧分，改善創面微環境，加速創面愈合有關。

適度的炎性反應可以調動機體免疫防護，清除細菌及壞死組織，保護宿主，但失控的、過度的炎性反應則可以導致組織損傷[12]。燒傷后由感染所致的全身性炎性反應與代償性抗炎反應綜合征相互作用的失衡即為燒傷膿毒癥。燒傷膿毒癥是燒傷后感染誘發的全身失控性炎癥反應綜合征，其發生機制極其復雜，涉及數量眾多相互協同、相互誘生的免疫炎癥細胞及細胞因子，但其中最為關鍵的是巨噬細胞[13-15]。在燒傷膿毒癥的發生、發展中，巨噬細胞既是啟動細胞，也是效應細胞，它的損傷與激活是機體發生失控性炎性反應、燒傷膿毒癥發病的關鍵環節。巨噬細胞在內毒素的刺激下，往往分泌大量炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等，造成了體內促炎及抗炎因子的失衡，從而引發級聯瀑布效應，最終導致炎性反應失控，誘發全身性損傷。因此，如何提高燒傷膿毒癥療效是亟待解決的難題。

TNF-α是炎性反應過程中出現最早、最重要的炎癥介質，其廣泛參與炎癥的發生發展并發揮重要作用[16-17]。無論急、慢性創面，經治療后早期TNF-α在創面組織中顯著下調；而同樣由活化的單核-巨噬細胞產生的與TNF-α有協同作用的IL-1β在急性創面中顯著下調，在慢性創面中無明顯變化[18-19]。經治療人體血清中促炎性細胞因子IL-6的水平無明顯變化[20]，IL-6與抗炎性細胞因子IL-10在體內往往存在負相關性，治療4 h后，血清中IL-10水平顯著升高[21]。IL-8是強力的趨化因子和促血管新生因子，在調節中性粒細胞和巨噬細胞的趨化中起著重要作用。研究表明[22]，經治療患者局部創面組織中IL-8顯著升高，但外周血中IL-8水平并無顯著升高。本研究顯示，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較對照組明顯減少，IL-8含量較對照組明顯增加（均P < 0.05），IL-10含量變化不明顯（均P > 0.05），與上述既往研究結果基本一致，提示VSD有可能通過調節局部炎性反應降低膿毒癥的全身炎性反應水平。

綜上所述，VSD治療C57BL/6J燒傷膿毒癥小鼠，可降低其創面細菌含量，改善血液供應，降低膿毒癥的全身炎性反應水平，提高生存率。

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（收稿日期：2018-08-07 本文編輯：任 念）