人血腦屏障通透性相關基因Caveolin—1的克隆及其蛋白表達、純化

招樹濤　徐永健　陳浩云

[摘要] 目的 克隆與人血腦屏障通透性相關基因Caveolin-1，并在大腸埃希菌中表達，最后進行蛋白純化、鑒定。方法 根據基因庫中收錄的Caveolin-1基因序列，設計其上下游引物，經過PCR反應合成Caveolin-1雙鏈，然后與pET28a（+）載體重組，篩選陽性克隆并對DNA序列分析鑒定。將已構建好的重組質粒pET28a-Caveolin-1轉入化大腸埃希菌BL21（DE3），異丙基硫代半乳糖苷誘導融合蛋白表達，表達產物經鎳離子親和層析（Ni2+-NTA）純化，SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。 結果 PCR擴增的Caveolin-1 DNA片段經鑒定確認為人Caveolin-1基因。經異丙基硫代半乳糖苷誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質粒的DE3菌表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經Ni2+-NTA親和層析純化，獲得了較高純度的融合蛋白。 結論 本研究成功克隆了人血腦屏障通透性相關基因Caveolin-1，并對其進行蛋白表達、純化，獲得了較高純度融合蛋白，為進一步的相關臨床研究奠定了基礎。

[關鍵詞] 血腦屏障；通透性相關基因；Caveolin-1；克隆；表達；純化

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（b）-0013-04

[Abstract] Objective To clone Caveolin-1， a gene related to human blood-brain barrier permeability， and express it in Escherichia coli. and to purify and identify the protein finally. Methods According to the sequence of Caveolin-1 gene contained in the gene bank， the upstream and downstream primers were designed. The Caveolin-1 double strand was synthesized by PCR and then recombined with pET28a （+） vector. Positive clones were screened and identified by DNA sequence analysis. The constructed recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1 was transfected into E. coli BL21 （DE3）， and the expression of the fusion protein was induced by IPTG. The expressed product was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography， identified by SDS-PAGE and Western blot. Results The Caveolin-1 DNA fragment amplified by PCR was identified as human Caveolin-1 gene. The recombinant human Caveolin-1 fusion protein was expressed by IPTG-induced DE3 strain containing the recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1. The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography to obtain a fusion protein of higher purity. Conclusion This study successfully cloned the blood-brain barrier permeability-related gene Caveolin-1， and expressed and purified the protein to obtain a higher purity fusion protein， which laid a foundation for further relevant clinical research.

[Key words] Blood-brain barrier； Permeability related gene； Caveolin-1； Cloning； Expressing； Purifying

腦梗死患者多死于腦水腫及出血性轉化，這與腦缺血組織中血腦屏障的受損密切相關[1]。Caveolins蛋白是小窩的主要結構成份，與小窩的形態構成及相關功能相關，其家族中包括Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3，其中Caveolin-1分布最為廣泛，且在不同的組織中表達水平不同[2]。Caveolins蛋白家族是血管通透性的重要調控因子[3-4]。Choi等[5]在《Stroke》雜志中發表的關于對鼠缺血性腦損傷模型研究表明，Caveolins家族中，尤其是Caveolin-1蛋白對缺血性損傷時血腦屏障通透性的調控作用更明顯，與血腦屏障的完整程度存在密切關系，Caveolin-1蛋白是血腦屏障通透性的重要調控因子，其可通過調節缺血損傷腦組織血腦屏障的通透性，降低水腫及出血性轉化的發生，這為臨床腦梗死的治療提供了新思路。理論上，體外操作可實現對腦梗患者受損腦組織中Caveolin-1蛋白的調控，降低腦水腫及出血性轉化的發生，從而提高腦梗死患者的治愈率并改善其愈后狀況。本研究擬參照葉棋濃[6]在《現代分子生物學技術與實驗技巧》中所述的研究方法，對人Caveolin-1基因進行克隆，并對其進行蛋白表達，以期獲得高純度的Caveolin-1蛋白，為Caveolin-1治療腦梗死的臨床前研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和質粒pET28a載體、DH5α菌株、大腸埃希菌（E.coli）BL21（DE3）、Taq酶、XhoⅠ、EcoRⅠ內切酶以及T4連接酶、蛋白Marker均購自TaKaKa公司，質粒提取及瓊脂糖凝膠回收試劑盒、鎳離子親和層析（Ni2+-NTA）預裝柱、化學發光顯色試劑均購自OMEGA公司，鼠抗人Anti-6×His抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG均購自浩天生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Caveolin-1基因擴增 根據Caveolin-1基因序列設計其上下游引物，并進行PCR反應，取PCR產物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。上下游序列如下：上游引入EcoRⅠ酶切位點，下游引入XhoⅠ酶切位點。正向引物（P1）：5′-ACATAAATTTTTTTCTCCAAATTAC-CTGAGTGTCAAGGTGTACGGACCCCTCCGAAGTGT-TAGTACCTCC-3′；反向引物（P2）：5′-TATTTTCGAT-GTCTCACTCTGCATGGGGCACTGGGCAGCCACAGA-AGTGAGGGTGCCATTGCTCTGCTTG-3′。PCR反應體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物P1 1 μL，引物P2 1 μL，Taq酶0.25 μL，模板2 μL，加水至50 μL。反應條件：94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s 2個循環，72℃延伸2 h。

1.2.2 重組質粒pET28a-Caveolin-1的構建 將Caveolin-1的PCR產物與pET28a載體DNA分別進行雙酶切，回收純化后進行連接，取連接產物10 μL轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，涂布于Kan抗性的LB平板上，37℃倒置過夜，次日隨機挑取菌落，接種于Kan抗性的LB液體培養基，37℃震蕩培養12 h，提取質粒，進一步測序鑒定。

1.2.3 重組人Caveolin-1融合蛋白的誘導表達 用接種環沾取少量含有重組質粒pET28a-Caveolin-1的保存菌，于LB（Kan+）平板上劃線，37℃倒置培養過夜。次日挑取單菌落，接種于5 mL LB （Kan+）液體培養基，37℃振搖培養過夜。次日取培養過夜菌液500 μL 再接種于50 mL選擇性LB液體培養基中，振蕩培養至OD600值達0.6。吸取1 mL后加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），終濃度為1 mmol/L，37℃繼續誘導培養4 h。取加IPTG前后的菌液各1 mL，12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，并于沉淀中加50 μL蒸餾水，混勻后再加2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液50 μL，混勻，沸水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，每個樣品取20 μL上樣于15%的SDS-PAGE膠上電泳鑒定。

1.2.4 重組人Caveolin-1融合蛋白的純化及Western blot檢測 將含有重組質粒pET28a-Caveolin-1的LB液體培養基擴大誘導培養，提純包涵體，并裂解復性。將復性產物緩慢加于已用磷酸鹽緩沖液（PBS）平衡的Ni2+-NTA親和層析預裝柱中，加樣所用的流速控制在1 mL/min內；PBS洗滌除去未結合蛋白，沖洗流速應控制在5 mL/min內；分別用含100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白，流速5 mL/min。取純化后的融合蛋白20 μL于15%的SDS-PAGE膠上上樣，并電泳；然后，電轉移至硝酸纖維素膜上膜上，進行Western blot印跡分析。

2 結果

2.1 PCR擴增

通過Caveolin-1基因上下游引物進行PCR，結果擴增出一個約700 bp的DNA片段。見圖1。

2.2 重組質粒pET28a-Caveolin-1序列分析

Caveolin-1基因與pET28a（+）載體連接后轉入表達菌株DH5α，隨機挑取單克隆菌落，提取質粒測序，結果與Genebank中Caveolin-1序列一致。

2.3 誘導重組人Caveolin-1融合蛋白的表達

Caveolin-1的分子量約20.47 KD，pET28a-Caveolin-1表達的Caveolin-1結果詳見圖2

2.4 重組融合蛋白的純化、鑒定

分別采用100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫，并對各洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳鑒定，重組融合蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以被完全洗脫。見圖3。經Western blot印跡分析，可見一清晰條帶，即Caveolin-1蛋白得到有效純化。見圖4。

3討論

腦卒中在世界范圍內都是引起死亡及致殘的主要原因之一。該領域的研究主要集中于缺血性損傷的細胞，并認為大腦血供不足很容易導致神經細胞受損及神經功能障礙，多種信號分子參與了這一過程[8-9]。細胞死亡并不是導致疾病的急性期患者死亡的直接原因，大部分腦梗死患者死于腦水腫及在缺血性腦組織中出現的出血性轉化。腦水腫可引起缺血性梗阻面積的擴大，并可通過一系列反應引發臨床癥狀的惡化。出血性轉化是公認的腦梗死伴發癥，其生理的特殊性限制了溶栓療法的臨床應用，進而導致腦梗死死亡的發生。腦梗死患者出現腦水腫及出血性轉化的嚴重后果是由血腦屏障的破壞而引起的[10]。維持血管完整性是腦缺血治療的靶標。然而，在臨床中維持血腦屏障完整性的治療是有限的。因此，了解血腦屏障破壞的潛在機制對腦卒中的治療及預后有重要意義。

Caveolins-1在中樞神經系統內參與調控血腦屏障滲出、氧化應激反應、神經炎性反應過程，還參與了髓鞘修復和神經元突觸再生等過程[11-12]。在腦缺血急性期，Caveolins-1過表達能夠降低血腦屏障滲透性、減輕腦水腫，進而減小腦梗死體積，發揮腦保護作用[13-14]。鐘義良等[15]的研究表明，血清Caveolins-1水平可作為急性腦梗死發生早期神經功能惡化的獨立預測因子。膜蛋白Caveolins是調控血管通透性的關鍵因子[4，16]。Caveolin-1是小窩蛋白的一種，這個家族是細胞膜的重要組成成份，是細胞膜表面小窩的標記蛋白[17]，其作為支架蛋白可結合信號分子調控細胞膜的穩定性，參與信號轉導、物質轉運、細胞增殖等活動[18-20]。Choi等[13]研究表明，Caveolins家族中的Caveolins-1可通過阻止緊密連接蛋白的降解，抑制基質金屬蛋白酶的活性來保護細胞膜的完整。降低腦缺血損傷時Caveolins-1的表達，對血腦屏障的通透性是有害的；增加腦缺血損傷時Caveolins-1的表達可保護血腦屏障的通透性，減少腦水腫及出血性轉化的發生。Caveolins-1是可維持血腦屏障通透性穩定的蛋白，可以作為治療腦梗死的靶標。未來有望通過體外調控缺血腦組織中Caveolins-1基因及其蛋白的表達，降低腦水腫及出血性轉化的發生，進而提高腦梗死患者的治愈率、改善其愈后狀況。

本研究依據基因庫中公布的Caveolins-1序列，自行設計了Caveolins-1基因的上游及下游引物片段，并對該基因進行了PCR，得到了Caveolins-1的PCR產物。產物經純化后與pET28a（+）載體連接，構建重組質粒pET28a-Caveolins-1，轉化宿主菌DH5α，培養后挑取的單克隆菌落經序列分析后確定重組片段為人血腦屏障通透性相關的Caveolin-1基因全長cDNA。經IPTG誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質粒的DE3菌，表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經Ni2+-NTA親和層析進行純化后，得到了較高純度的融合Caveolins-1蛋白。這為今后Caveolins-1治療腦梗死的研究奠定了基礎。

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（收稿日期：2017-12-08 本文編輯：任 念）