活血降糖飲對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的防治作用及對scrib蛋白表達的影響

劉德亮　李惠林　渠昕

[摘要] 目的 研究活血降糖飲對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的防治作用及對scrib蛋白表達的影響。 方法 通過高脂高熱卡飲食和小劑量鏈脲佐菌素尾靜脈注射誘導建立2型糖尿病模型大鼠，應用SPSS軟件將模型大鼠隨機分為模型組、中藥組、雙胍組，另設正常組，每組各10只。藥物干預后檢測血脂、血糖及胰島素，并應用原位末端標記法檢測胰島β細胞凋亡情況；分離純化胰島細胞后，通過免疫印跡方法檢測各組大鼠胰島細胞scrib蛋白表達。 結果 與模型組比較，中藥組和雙胍組大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹胰島素、餐后2 h胰島素、胰島素抵抗指數和總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇均明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），而高密度脂蛋白膽固醇無明顯變化，差異無統計學意義（P > 0.05）。與模型組比較，中藥組和雙胍組大鼠胰島β細胞凋亡指數亦明顯降低（P < 0.01），胰島細胞scrib蛋白表達明顯上調（P < 0.01）。 結論 活血降糖飲干預治療具有調脂降糖、改善胰島素抵抗的作用，并可有效防治β細胞凋亡，其作用機制可能與上調胰島細胞scrib蛋白表達有關。

[關鍵詞] 活血降糖飲；2型糖尿病；細胞凋亡；Scrib；Hippo通路

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（c）-0004-05

The preventive effect of Huoxue Jiangtang Decoction on pancreatic β cell apoptosis and its influence on scrib protein expression in type 2 diabetes rats

LIU Deliang1 LI Huilin1 QU Xin1 ZHAO Hengxia1 CHU Shufang1 LIU Xuemei1 ZENG Lin2 ZHANG Xuewen2

1.Department of Endocrinology， Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518033， China； 2.the Fourth Clinical Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Shenzhen 518033， China； 3.Institute of Traditional Chinese Medicine Master， Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712046， China

[Abstract] Objective To investigate the preventive effect of Huoxue Jiangtang Decoction on pancreatic β cell apoptosis and its influence on scrib protein expression in type 2 diabetes mellitus rats. Methods The type 2 diabetes mellitus model was induced by high fat and high calorie diet and intravenous injection of low dose of Streptozotocin. By SPSS software， all model rats were divided into model group， herbal group， Metformin group， besides， normal group was added， 10 rats in each group. After treatment， the blood glucose， insulin and lipids were tested； the pancreatic β cell apoptosis was examined by terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling method； and scrib protein expression was detected by Western blot in extracted and purified pancreatic islet cells. Results Compared with model group， the levels of fasting blood-glucose， 2 h postprandial blood glucose， fasting insulin， 2 h postprandial insulin， insulin resistance index and total cholesterol， triacylglycerol， low density lipoprotein cholesterin in herbal group and Metformin group were all decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）， while high density lipoprotein cholesterol had no obvious changes， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with model group， the β cell apoptosis indices in herbal group and Metformin group were also decreased （P < 0.01）， meanwhile， the scrib protein expression in islet cells was increased significantly （P < 0.01）. Conclusion Huoxue Jiangtang Decoction treatment has the effects of regulating blood lipid， decreasing blood glucose， improving insulin resistance， which can effectively prevent β cell apoptosis. The mechanism may be related to the upregulation of scrib protein expression in islet cells.

[Key words] Huoxue Jiangtang Decoction； Type 2 diabetes mellitus； Cell apoptosis； Scrib； Hippo pathway

生活水平提高和飲食結構改變導致我國2型糖尿病（T2DM）發病率逐年增加[1-2]。在T2DM的進展過程中，β細胞凋亡是重要的病理生理過程之一[3-4]。導致β細胞凋亡的原因眾多，近期研究發現，scrib蛋白可通過Hippo信號通路發揮抗凋亡作用[5-6]，筆者前期研究發現，T2DM大鼠胰腺scrib蛋白表達下調，可能是導致β細胞凋亡的原因之一[7]。目前針對β細胞凋亡的防治手段非常有限，因此，有必要開發具有β細胞保護作用的藥物。活血降糖飲是深圳市中醫院內分泌科協定處方，具有益氣養陰、活血通絡的作用，筆者前期研究提示其具有良好的降糖調脂作用[7]。本研究建立T2DM大鼠模型，進一步探討活血降糖飲對β細胞凋亡的防治作用和對scrib蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，50只（合格證號：44002100006561），約2月齡，體重180 g左右，雄性SD大鼠（SPF級）。飼養環境：溫度18～22℃，濕度40%～70%，自由攝食、飲水，自然晝夜節律光照。常規對照飼料（熱量構成：脂肪13%，蛋白質23%，碳水化合物64%）及高脂飼料（熱量構成：脂肪60%，蛋白質20%，碳水化合物20%）均購于廣東省醫學實驗動物中心。

1.2 實驗藥物

活血降糖飲制劑的準備按本課題組前期研究中所采用的方法準備[7]，二甲雙胍為中美上海施貴寶出品（商品名：格華止，AAP0010），用蒸餾水溶解，調整濃度至20 mg/mL，4℃儲存。

1.3 試劑與儀器

血糖、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（F006、F002、A110-1、A113-1、A112-1）；胰島素放免試劑盒購于北京原子能科學研究所（YB-10069）；鏈脲佐菌素（STZ）、Histopaque、Cy3標記的抗兔IgG購自Sigma公司（S0130、10771、C2821）；小牛血清購于美國GIBICO公司（10100147）；膠原酶P、TUNEL試劑盒購于羅氏公司（Roche）（11213865001、11684795910）；兔抗大鼠胰島素、scrib、β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司（sc-28737、sc-10731）；蛋白抽提試劑盒及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德公司（AR0101、BA1054）。

主要檢測儀器采用DYCZ-24型垂直板電泳槽（北京六一儀器廠）和LSM700激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物模型和分組 經過1周的適應性喂養后，隨機選出10只大鼠作為正常組，標準飼料喂養，自由進食進水。以高脂高熱卡飲食喂養其余大鼠，4周后，模型組大鼠按30 mg/kg劑量尾靜脈注射用檸檬酸緩沖液配制的2% STZ溶液，1周后，各組大鼠均行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），檢測空腹血糖（FPG）及餐后2 h血糖（2 h PBG），通過正常組大鼠計算FPG、2 h PBG 95%可信區間，FPG、2 h PBG均高于正常范圍上限20%認為T2DM模型成功，應用SPSS軟件將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、中藥組、雙胍組，加上正常組共四組，每組各10只。

1.4.2 動物處理 正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃，中藥組灌服活血降糖飲煎劑，劑量為5 g/（kg·d）（按生藥質量換算），雙胍組以200 mg/（kg·d）劑量治療。治療期間正常組喂以常規飼料，其他組均繼續喂以高脂高熱卡飼料。各組均治療8周后，行OGTT，檢測FPG、2 h PBG、空腹胰島素（FINS）、餐后2 h胰島素（2 h INS），1周后，禁食24 h，腹腔注射麻醉（戊巴比妥鈉45 mg/kg）后，腹主動脈取血，分離血清檢測血脂，各組隨機選取3只大鼠取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片；另外7只大鼠通過原位灌注法分離胰島細胞，用于檢測scrib蛋白表達。

1.5 觀察指標

①按照試劑盒說明書檢測各血清學指標。②TUNEL法檢測胰島β細胞凋亡：嚴格按照試劑盒說明書操作。③胰島細胞分離和純化：按參考文獻[8]的方法分離胰島，大鼠取血后，經膽總管注射0.75 mg/mL膠原酶P（4℃預冷）10 mL（pH 7.6～7.8，Ca2+ 7.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L），迅速摘取膨脹的胰腺，置于Hank液中，38℃消化10 min，加入4℃ Hank液（含10%小牛血清）終止消化，過600 μm鋼篩后，Hank液重懸，4℃，1000 r/min離心2 min（r = 144 mm）洗滌×2次后，4℃，3000 r/min，20 min（r = 144 mm），Histopaque梯度離心純化胰島，取中間界面的胰島細胞，4℃ Hank液1000 r/min離心2 min（r = 144 mm）洗滌2次備用。④Western blot檢測胰島細胞scrib蛋白表達：分離純化的胰島細胞按按照蛋白抽提試劑盒說明書操作提取總蛋白，考馬斯亮藍G-250測定蛋白濃度；10% SDS-PAGE凝膠電泳（各樣品上樣量均為50 μg），濕轉法轉膜后，封閉2 h，4℃孵育過夜（抗體工作濃度為1∶1000），第2天TBST洗膜后用二抗孵育2 h（二抗工作濃度為1∶5000）后，進行雜交ECL化學發光。分析每條帶的吸光度值，用蛋白/內參（β-actin）的比值表示各蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法

統計學分析采用SPSS 22.0軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，各組間差異采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間多重比較，使用Bonferroni檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖、胰島素及胰島素抵抗指數（HOMA-IR）比較

與正常組比較，模型組FPG、2 h PBG、FINS、2 h INS、HOMA-IR均明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，中藥組、雙胍組FPG、2 h PBG、FINS、2 h INS、HOMA-IR均明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠血脂水平比較

與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C均明顯升高，HDL-C明顯下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，中藥組、雙胍組TC、TG、LDL-C均明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而HDL-C無明顯變化，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠β細胞凋亡情況比較

激光共聚焦顯微鏡下觀察，紅色熒光為胰島β細胞，綠色熒光為凋亡細胞，紅色熒光和綠色熒光重疊為凋亡的β細胞。每張切片隨機選取4個視野，計數每個視野胰島中標記的陽性凋亡細胞數及胰島細胞總數。根據凋亡細胞數占胰島總細胞核數百分比計算凋亡指數（AI），取平均值。正常組β細胞凋亡較少（圖1A～C，封三）；模型組β細胞凋亡細胞明顯增多（圖1D～F，封三）；中藥組、雙胍組β細胞凋亡較模型組明顯減少（圖1G～L，封三）。由圖1M（封三）所見，模型組β細胞凋亡指數明顯高于正常組（P < 0.01），而各治療組胰島β細胞凋亡指數明顯低于模型組（P < 0.05）。

2.4 各組大鼠胰島β細胞scrib蛋白表達情況

圖2為提取純化的β細胞。與正常組比較，模型組scrib蛋白表達明顯下降（P < 0.01），而與模型組比較，中藥組和雙胍組scrib蛋白表達均明顯上調，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖3。

3 討論

細胞凋亡是細胞死亡的一種方式，中醫理論對死亡的認識大多認為“陰陽離決，精氣乃絕”，從維持陰陽平衡以維持生命活動和陰陽相互關系來看，“陰者，藏精氣而其亟也”，說明陰精是人體生命活動的物質基礎，《黃帝內經》中亦有云：“奉陰者壽，任陽者夭。”細胞是人體的組成部分，細胞的生死與人的生老病死息息相關，如β細胞的大量死亡則會導致糖尿病的發生，結合經典的“三消”理論，應用中醫理論辨治糖尿病應以益氣養陰為大法。

活血降糖飲是本課題組所在國家重點專科協定處方，由黃芪、生地、丹參等中藥組成，具有益氣養陰、活血化瘀的功效。本課題組前期研究表明[9-10]，T2DM患者除血糖外，其血TC、TG較正常對照組顯著升高，經用活血降糖方治療后，FPG、TC均顯著降低。本研究再次提示，活血降糖飲對T2DM動物模型具有良好的降糖調脂、改善胰島素抵抗的作用，同時，可以改善β細胞凋亡。

細胞凋亡的誘發因素、發生機制和涉及到的信號途徑眾多，如氧化應激與炎癥途徑[11]、內質網應激[12]、Caspase家族、B細胞淋巴瘤蛋白家族途徑[13]等。而Hippo通路是近年發現的一條進化上保守的信號級聯通路，它可以通過調節細胞增殖、凋亡、分化和干/祖細胞命運來控制器官大小[14]，此通路活化后抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[15-16]。Yes相關蛋白（YAP）作為該信號通路重要的核心轉錄共激活因子，可通過不同通路促進細胞凋亡[17-18]。scrib屬于腫瘤的腫瘤抑制基因[19]，近來，scrib被證明參與Hippo信號轉導通路[20-21]，研究表明，scrib能與Fat1相互作用抑制YAP在核內定位及激活，從而抑制細胞凋亡[22-23]。

本研究發現，模型組大鼠胰島細胞scrib蛋白表達下調，而經活血降糖飲治療后，胰島細胞scrib蛋白表達上調，這可能是活血降糖飲抑制胰島細胞凋亡的作用機制之一。在以后的研究中，將進一步研究活血降糖飲對Hippo信號通路中其他重要信號分子的調控作用，以進一步闡明活血降糖飲降糖調脂的作用機制。

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（收稿日期：2018-03-16 本文編輯：張瑜杰）