頤腦解郁方對缺血性腦卒中及卒中后抑郁、焦慮、癡呆大鼠宏觀表征變化的干預作用

趙子珺 趙瑞珍 張 媛 趙 蕓 鄭春翔 唐啟盛

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京，100029)

腦卒中是導致我國居民死亡的第一大病因，其發病率呈逐年升高的趨勢[1-2]。腦卒中后精神疾患的出現，直接影響患者的生命質量、軀體功能和認知功能的康復，提高腦卒中的病死率[3-5]。目前對于卒中后精神疾患的治療，西藥具有較強的不良反應，患者普遍依從性差[5]，與之相比，中醫在腦卒中及卒中后精神疾患的治療方面具有一定優勢和發展潛力。異病同治是中醫辨證論治的特色和精髓，唐啟盛教授在既往對腦卒中后精神疾病的臨床研究中發現，其中醫證候多屬于腎虛肝郁型，采用益腎調氣中藥收效顯著。“有諸內必形諸外”，動物宏觀表征是內在病理變化的外在體現，以宏觀表征為著眼點開展研究，比較接近臨床診病過程，符合中醫整體觀和辨證論治的臨床思路，同時也是建立中醫“病證結合”模型的較好切入點[6]。因此，本研究復制缺血性腦卒中、PSD、PSA、VaD動物模型，動態觀察腦卒中向PSD、PSA、VaD演變過程中不同模型、不同時點的表征變化特點。探討各模型表征演化趨勢，并進行證候評價；再以益腎調氣方藥頤腦解郁方對模型大鼠進行干預，同時以“藥物反證”驗證證候模型，觀察并記錄用藥后大鼠體重及表征變化情況，以期評價益腎調氣方藥頤腦解郁方的治療作用，并為卒中后精神疾患的病證結合研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性wistar大鼠，體重(200±10)g，6周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006。飼養于室溫(20±2)℃、相對濕度50%～60%的環境，光照節律12 L/12 D(6：00-18：00)。預養1周后,進行Open-field行為學評分,取評分相近的大鼠,隨機分為卒中模型組、卒中觀察組、卒中假手術組、PSD模型組、PSD觀察組、PSD假手術組、PSA模型組、PSA觀察組、PSA假手術組、VaD模型組、VaD觀察組、正常組，每組8只。

1.1.2 藥物 頤腦解郁方(藥物組成：刺五加20 g、郁金10 g、白芍10 g、梔子10 g)，由北京中醫藥大學第三附屬醫院提供。以相當于成人劑量的7倍計算，配成419 mg/kg混懸液(即1劑配方顆粒加100 mL蒸餾水)，貯存于4 ℃冰箱中備用，臨用前加熱。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(P3761-5，Sigma)，尼龍栓線(2838-A4，北京沙東生物技術有限公司)；大鼠夾尾夾(自制)、大鼠束縛架(自制)。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 進購動物并適應性預養1周后，通過Open-filed實驗評分將大鼠隨機分為以下12組：卒中模型組、卒中觀察組、卒中假手術組、PSD模型組、PSD觀察組、PSD假手術組、PSA模型組、PSA觀察組、PSA假手術組、VaD模型組、VaD觀察組、正常組。

腦卒中模型：參考新式線栓法[7]，制備大腦中動脈梗死的腦卒中模型。動物禁食水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg體重)麻醉動物。頸正中線切口3 cm左右，鈍性分離，暴露右側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區域，沿胸鎖乳突肌內側分離肌肉筋膜，暴露CCA，結扎CCA近心端，距此節1 cm處的CCA遠心端系一松節備用，在CCA近ICA分叉處以動脈夾暫時夾閉，在CCA的兩線間，距CCA分叉處5 mm左右，剪一小口，松開動脈夾，插入經多聚賴氨酸處理的尼龍栓線，在栓線標記接近CCA與ICA分叉處或遇阻力感時停止，2 h后進行再灌注。入組標準：大鼠于缺血再灌注2 h后出現對側前肢蜷曲、行走轉圈或行走向對側倒體征則納入，無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。假手術組僅分離CCA、ICA，不插入栓線。

PSD模型：參考導師唐啟盛教授[8-9]方法復制PSD模型。首先建立腦卒中模型，手術1周后，單籠飼養，并予21 d慢性不可預知溫和應激(CUMS)，包括：禁食24 h、禁水24 h、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒、夾尾1 min、束縛3 h、鼠籠傾斜24 h，每種方法使用3次。

PSA模型：腦卒中模型術后1周，采用不確定性空瓶飲水應激復制卒中后焦慮模型。術后經1周適應期后，進行定時喂水訓練7 d，每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10給動物飲水，其他時間撤去水瓶不給水。第8天至第21天，進行應激實驗，每天在上述2個時間段內，隨機選取一個時間段給予空瓶刺激，另一時間段喂水，刺激的給予是無規律的，但維持1次/d。

VD模型[10]：建立MCAO模型后，大鼠常規飼養，28 d后進行水迷宮評價，(實驗組大鼠平均逃避潛伏期-正常組組大鼠平均逃避潛伏期)/實驗組大鼠平均逃避潛伏期>20%定為VD鼠，進入實驗。

正常組：正常飼養。

1.2.2 干預方法 卒中組自手術1周后開始藥物干預，觀察組給予頤腦解郁方灌胃，模型組、假手術組均給予蒸餾水灌胃，灌胃劑量10 mL/kg，1次/d，持續2周。PSD組、PSA組、VaD組及正常組，于應激結束后開始藥物干預，觀察組給予頤腦解郁方灌胃，正常組、模型組、假手術組均給予蒸餾水灌胃，灌胃劑量10 mL/kg，1次/d，持續4周。

1.2.3 檢測指標與方法 一般狀態觀察：每周觀察大鼠的行為活動、精神狀態、對外界刺激的反應性、被毛色澤、糞便、舌色等。大鼠體重增長情況測量：實驗開始后，每周監測大鼠體重，并根據體重調整給藥量。計算卒中組大鼠灌胃第1、2周以及PSD、PSA、VaD組灌胃第1、2、4周體重增長情況。

2 結果

2.1 一般狀態觀察結果 為更好地體現大鼠表征動態變化情況，觀察結果根據時間順序進行描述。見圖1。

實驗前，各組大鼠精神狀態良好，對外來刺激反應靈敏，行為活躍，被毛致密緊披有光澤，麥粒型糞便且干稀適中，舌色淡紅，舌下脈絡不明顯、呈淡紫色。

2.1.1 缺血性腦卒中組

2.1.1.1 術后1周 手術大鼠術后蘇醒表現為弓背、少動或不動，行走時左側肢體力弱，或向左側轉圈，或向左側傾倒，抬頭困難；精神狀態萎靡不振，雙眼黯淡無神，少數大鼠觸之不動；豎毛；糞便麥粒型，粒細小，質硬色深。術后1周內，抬頭困難表現逐漸減少至消失，肢體力弱、轉圈、傾倒的表現趨于好轉，少數大鼠弓背蜷縮、少動；精神狀態、反應靈敏性好轉，無觸之不動表現；少數大鼠豎毛持續；糞便棕色麥粒型，質軟；口鼻顏色較黯淡，爪甲及足底淡紅色，耳廓微血管清晰淡紅；舌色淡紅。

假手術大鼠手術蘇醒后活動度低，抬頭困難，無偏癱、追尾表現；精神狀態差，雙眼黯淡；豎毛；糞便麥粒型，粒細小，質硬色深。假手術大鼠術后7 d內行為活動、精神狀態、被毛色澤、糞便等恢復正常。行為活躍，雙眼眼大紅亮、動眼靈活，毛色純白，被毛致密緊披有光澤，糞便棕色麥粒型，質軟；口鼻潤澤、呈淡粉色，爪甲及足底淡紅色，耳廓微血管清晰淡紅；舌色淡紅。

2.1.1.2 術后2周 模型組大鼠活動度略低于假手術組，精神狀態稍差，部分大鼠瞇眼；被毛色白，欠光澤，少數大鼠豎毛；糞便棕色麥粒型，質軟；口鼻顏色稍黯淡，爪甲及足底淡紅色，耳廓微血管清晰淡紅；舌色淡紅。

圖1 實驗流程圖

卒中觀察組大鼠活動度較前略增加；精神狀態改善，雙眼較模型組紅亮，動眼靈活；被毛色白，豎毛減少；糞便深棕色麥粒型，質軟；口鼻顏色稍黯淡，爪甲及足底淡紅色，耳廓微血管清晰淡紅；舌色淡紅。

卒中假手術組宏觀表征較前無明顯變化。

2.1.1.3 術后3周 模型組部分大鼠活動度減低，梳理次數減少，倦臥，精神狀態轉差，雙眼黯淡，聞響后反應欠靈敏，口鼻顏色黯淡，舌色較前紫暗；同時可見部分大鼠攻擊行為較前增加，舌色較前者紅。少數大鼠出現淺棕色稀便。

卒中觀察組大鼠無明顯活動度減低、攻擊行為增加表現，反應性可，聞響即抬頭。糞便棕色麥粒型，質軟，未見稀便。舌色淡紅，口鼻顏色淡紅。

卒中假手術組大鼠表征同前，無明顯改變。

2.1.2 卒中后精神疾病組

2.1.2.1 術后2周 PSD大鼠出現明顯的易激惹表現，束縛及夾尾時可見明顯反抗、嘶叫、毛須豎立，抓取時反抗明顯；被毛色白，豎毛；束縛時，大鼠排泄行為增加，為棕色軟便或稀便，未行束縛時糞便棕色麥粒型、質軟；口鼻顏色稍黯，舌色淡紅。

PSA大鼠探究行為、攻擊行為明顯增多；反應靈敏性高，輕微響聲即抬頭；被毛色白，豎毛不明顯；糞便棕色麥粒型，質硬。舌少津，色淡紅。

VaD大鼠行為活動較前無明顯改變，精神狀態稍差，部分大鼠雙眼黯淡無神，被毛色白，欠光澤，少數大鼠豎毛。糞便棕色麥粒型，質軟。舌色淡紅。

2.1.2.2 術后3周 PSD大鼠活動度較前減低，修飾行為減少，精神狀態轉差，束縛及夾尾時反抗、嘶叫程度減低，掙脫束縛次數減少,出現脫毛現象，被毛凌亂欠光澤。束縛時，大鼠排泄行為增加，為棕色軟便或稀便，未行束縛時多為棕色麥粒型軟便，偶見稀便。口鼻黯淡，舌色稍顯紫暗。

PSA大鼠探究行為、攻擊行為持續，修飾行為減少，有明顯啃咬鼠籠行為，抓取反抗明顯，給水時段搶奪水瓶激烈。部分大鼠豎毛，被毛欠光澤。糞便麥粒型，粒小色黑質硬。舌紅少津。

VaD大鼠自發活動減少，梳理次數減少，部分大鼠倦臥、對外界刺激反應性下降，被毛欠光澤，偶有稀便。舌潤澤，舌色淡紅。

2.1.2.3 術后4周 PSD大鼠活動度低，自發活動較少，倦臥、少動，喜蟄伏于鼠籠角落，精神狀態差，瞇眼、雙眼黯淡，反應淡漠，聞響后不抬頭，抓取反抗。被毛干枯雜亂無光澤，毛色白中夾黃，脫毛現象持續。形瘦。多為棕色麥粒型軟便，偶見稀便。足底顏色偏紫，口鼻黯淡，舌色紫暗，舌下脈絡清晰、呈青紫色。

PSA大鼠攻擊行為、探究行為、修飾行為同前，鼠籠托盤內可見大量細碎飼料殘渣(為大鼠啃咬飼料但不食入所致)。抓取時呈弓背抬頭的攻擊姿態，抓取反抗激烈、嘶叫。形瘦，豎毛，被毛欠光澤，脫毛。糞便麥粒型，粒小色黑質硬。口鼻黯淡，舌紅少津。

VaD大鼠少動、扎堆、倦臥、不活躍，精神狀態較差，閉目趴臥時間較長，對外界刺激反應性下降，行動略遲緩，被毛色白欠順滑，時有稀便。口鼻色稍暗，舌潤澤，舌色淡紅。

2.1.2.4 術后5～8周 PSD模型組、假手術組大鼠經灌胃后行為活動、精神狀態、被毛色澤等均較灌胃前無明顯差異。

PSD觀察組大鼠經灌胃后，較應激后活躍，于角落蜷縮蟄伏等表現減少，對外界刺激興奮性增加，脫毛現象明顯減輕，被毛較前順滑，稀便現象減少。舌色稍暗，舌下脈絡淡紫。

PSA模型組、假手術組大鼠停止應激并灌胃后無搶奪水瓶表現，探究行為較前減少，攻擊、啃咬鼠籠行為略減少。稀便增多，肛周污染明顯。脫毛。舌較前潤澤，舌紅。

PSA觀察組大鼠探究行為減少，梳理次數增加，攻擊及啃咬鼠籠行為明顯減少，抓取反抗程度減低，脫毛現象減少，糞便質軟色棕。舌體潤澤，舌色淡紅。

VaD模型組大鼠經灌胃后，行為活動、精神狀態、被毛色澤等均較灌胃前無明顯差異。舌多津，舌色淡紅。

VaD觀察組大鼠經灌胃后，自發活動、梳理次數增加，精神狀態改善，倦臥減少，稀便現象減少。舌體潤澤，舌色淡紅。

2.2 大鼠經灌胃后體重測量結果

2.2.1 卒中組大鼠體重測量結果 見表1。卒中組及正常組大鼠體重均呈現上升趨勢。治療1周后，卒中觀察組較模型組體重略有升高，但無明顯差異。模型組、觀察組體重顯著低于假手術組、正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。治療2周后，觀察組與模型組比較，體重有明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，且與假手術組比較無顯著差異。模型組與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。在治療1周后及2周后時點上，卒中各組體重均顯著低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 卒中組大鼠體重測量結果

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表2 PSD組大鼠體重測量結果

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表3 卒中后焦慮組大鼠體重測量結果

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表4 血管性癡呆組大鼠體重測量結果

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖2 卒中后精神疾病發展示意圖

2.2.2 PSD組大鼠體重測量結果 見表2。各組大鼠體重均呈上升趨勢。治療1周及2周后，PSD觀察組較模型組體重均有升高，但不具有統計學差異，且模型組、觀察組體重顯著低于假手術組、正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。治療4周后，中藥組較模型組體重有顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)，仍明顯低于假手術及正常組，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。各時點假手術組體重均低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.3 PSA組大鼠體重測量結果 見表3，治療4周內，各組大鼠體重呈上升趨勢。治療1周及2周后，模型組、觀察組、假手術組之間無統計學差異。治療4周后，模型組大鼠體重明顯低于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組與假手術組間無統計學差異。各時間點，正常組與PSA各組比較，體重均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.4 VaD組大鼠體重測量結果 見表4，各組大鼠體重總體呈上升趨勢。在治療1周、2周、4周時間點上，模型組大鼠體重均顯著低于正常組，觀察組體重略高于模型組，但二者間差異無統計學意義。

3 討論

3.1 卒中后精神疾病的發展演化及頤腦解郁方的立方依據 前期臨床及基礎研究發現，腦卒中患者發病后可出現情緒不穩、認知功能受損、思維遲滯、注意力下降及睡眠障礙等精神癥狀組群[11]，據其特征表現可歸屬于閾下抑郁、閾下焦慮或早期癡呆的范疇，其中部分患者最終發展為卒中后精神疾病。據此，唐啟盛教授提出，PSD、PSA、VaD是由卒中后精神癥狀組群階段發展而來。見圖2。

中醫認為，中風病的發展轉歸，由內風、痰濁、邪熱、瘀血等病因與機體正氣相爭及其消長、變化的結果所決定。中風病后，若腎精虧耗，氣虛痰阻，血行不暢，筋脈失養，則可出現行動遲緩、記憶力減退等癥狀；肝郁氣滯，痰瘀氣結者，可見郁郁寡歡等癥狀；氣郁化火，郁火痰熱，擾亂心神者，又可出現煩躁焦慮、擔憂緊張等表現。隨著病程遷延，若心神失養，營血受損，肝郁加重，可出現心情抑郁、時時欲哭、悲觀絕望、失眠等抑郁癥表現；氣郁化火，灼傷陰津，肝腎陰虛，心失所養則可出現坐立不安、煩躁擔心及汗出、心悸、手抖等一系列植物神經癥狀的焦慮樣表現；病程纏綿，瘀久致虛，氣血虧耗，髓海不足，又可導致癡呆癥狀的出現，如情感淡漠、反應遲鈍、認知功能障礙等。

究其病機之根本，不外乎氣機阻滯、腦絡痹阻屬實；氣血不足、腎精虧虛、腦失所養屬虛。根據中醫理論，并結合多年臨床經驗，唐啟盛教授認為，中風后情志疾病證屬本虛標實，腎精虧虛為本，氣機壅滯為標。其治療當以補腎疏肝、調氣通絡、解郁安神為治療原則，以此立補腎調氣之法，以固本解郁為要，而又虛實兼顧，組成復方頤腦解郁方。臨床應用于中風后情志疾病，收效滿意。頤腦解郁方由刺五加、五味子、郁金、梔子組成，方中刺五加益氣健脾，補腎安神；郁金疏肝解郁，行氣活血，清心安神；五味子益氣生津、補腎寧心；梔子瀉火除煩。四味藥物共奏補腎調氣之功效。現代藥理學研究同樣提示上述藥物具有一定的腦保護作用，方中刺五加包含的苷類物質具有減緩腦缺血損傷、抗疲勞作用[12-13]，郁金包含的主要活性成分為姜黃素類及揮發油兩大類，具有抗抑郁功效[14]；五味子的主要活性成分五味子乙素具有保護腦神經的作用[15]；梔子的活性成分具有抗焦慮活性及神經保護作用[16]。

3.2 腦卒中向PSD、PSA、VaD演化過程中的表征變化趨勢 在本研究中觀察到，卒中模型組大鼠在術后3周時宏觀表征出現分化，部分大鼠倦臥、精神狀態萎靡、對外界刺激反應性下降，同時可見部分大鼠攻擊行為較前增加。這與前期研究中精神癥狀組群階段具有相同表現。此外，研究結果可見腦卒中向PSD、PSA、VaD發展演化過程中，大鼠的宏觀表征變化趨勢確有不同。

卒中大鼠向PSD演變過程中，首先出現明顯的易激惹表現，如束縛及夾尾時反抗、嘶叫、毛須豎立、竄叫不安，抓取時呈現站立攻擊姿態、反抗激烈，而后攻擊性、對外界刺激反應性、活動度均逐漸降低，至應激結束后，表現為少動、蟄伏于鼠籠角落，修飾行為少，對外界刺激反應性低，形瘦，被毛結縷、無光澤，足底顏色偏紫，口鼻黯淡，舌色紫暗，舌下脈絡發紺。

卒中大鼠向PSA演變過程中，可見攻擊性行為、探究性行為明顯增加，而后出現修飾行為減少。至空瓶應激結束后，PSA大鼠表現為攻擊性高、探究性高，抓取時嘶叫、反抗激烈，修飾行為少，形瘦，豎毛，糞便粒小色黑質硬。口鼻黯淡，舌紅少津。

卒中大鼠向VaD演變過程中，呈活動度、精神狀態、反應性逐漸下降趨勢，至術后4周，表現為自主活動少，行動較遲緩，精神狀態差，倦臥，對外界刺激興奮性低，被毛色白欠順滑。偶有稀便。口鼻色稍暗，舌潤澤，舌色淡紅。

3.3 益腎調氣方藥的干預作用及卒中后精神疾病的“病證結合”探索 動物模型是中醫藥基礎研究的橋梁和重要載體，建立同時具有西醫疾病病理和中醫證候特點的“病證結合”動物模型是中醫藥研究中亟需解決的問題，并已逐漸成為中醫實驗動物模型發展的新方向。腎虛肝郁證是中醫腎虛證與肝郁證的復合證，具有腎虛、肝郁的加和內涵。本研究結果可見，各組大鼠具有不同程度的自主活動減少、抓取反抗、對外界刺激興奮性低、精神萎靡、泄瀉、脫毛等表現，與《中醫診斷學》中關于腎虛及肝郁證的描述“精神萎靡、久瀉不止、發脫、情志抑郁、脅肋脹痛、急躁易怒”等相符合。除此之外，PSD、PSA、VaD模型大鼠宏觀表征也不盡相同，各模型具有諸多特異性表征，提示各模型腎虛和肝郁的偏重有所不同。PSD大鼠活動度低、精神狀態差、舌色紫暗、舌下脈絡發紺，提示疾病證候偏重于肝郁；PSA大鼠攻擊性高、抓取反抗激烈、舌紅少津，提示偏重于肝郁化火；VaD大鼠活動度低、精神萎靡、時有稀便、舌淡，其證候類型偏重于腎虛。在應用益腎調氣中藥頤腦解郁方后，各模型大鼠在行為活動、精神狀態、被毛色澤、糞便情況及體重等方面均有不同程度的改善，揭示了益腎調氣方藥對治療腦卒中及卒中后精神疾病的有效性，并從藥物反證的角度進一步驗證了腎虛肝郁的證候模型。

本研究從動物宏觀表征入手，對腦卒中及卒中后精神疾患的“病證結合”進行了初步探索，但尚缺乏客觀指標的佐證，在下一步的研究中，可以運用現代檢測指標進一步印證中醫證候。就目前而言，明確的評價標準和公認的評價方法，需要我們在以后的研究中不斷摸索和完善。

綜上所述，本研究初步驗證卒中后精神疾病在其演變過程中具有腎虛肝郁的共同病機，益腎調氣方藥頤腦解郁方對缺血性腦卒中及卒中后精神疾病具有一定療效，并為腦卒中、卒中后精神疾病的“病證結合”研究提供實驗依據。