推拿改善T2DM大鼠糖脂代謝性炎性損傷的分子機制研究

王 康 孟鳳仙 鈕 妍 薛恬玨 國 生 沈 潛 魏培棟 付國兵

(1 北京中醫藥大學東方醫院，北京，100078； 2 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京，100029； 3 北京中醫藥大學，北京，100029)

隨著社會發展和人民生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后另一個嚴重危害人民健康的慢性非傳染性疾病。我國糖尿病的患病率近年來呈快速上升趨勢，成人糖尿病患病率達11.6%，糖尿病前期患病率更高達50.1%[1]。既往普遍認為，IR和胰島β細胞功能衰竭是T2DM的2個主要發病機制，但隨著近年來研究的不斷深入，相繼發現糖脂毒性、慢性炎性反應、微循環功能異常及胰島β細胞去分化等因素也與T2DM的發病關系密切[2]。其中改善糖脂毒性并控制其引起的慢性炎性損傷已成為T2DM的臨床治療的核心[3]。因此，骨骼肌AMPKα2以其對糖脂代謝及炎性反應的強大調控能力成為了近年來學術界研究的熱門靶點，AMPKα2的激活不僅可通過調控GluT4、ACC1/2等分子改善機體糖脂代謝，還可抑制NF-κB信號途徑介導機體的慢性炎性反應，從而緩解糖脂毒性對機體的損傷[4]。

近年來，推拿已廣泛應用于T2DM的臨床治療，且隨著大量臨床研究的開展，已基本明確了推拿的臨床療效，但對于手法作用機制的研究當前仍處于起步階段，本團隊在前期研究中已發現推拿可通過調節AMPK/Glut4信號鏈改善T2DM大鼠的糖代謝水平[5]。因此，本次研究繼續對推拿在抑制T2DM慢性炎性反應中發揮的手法效應機制進行了分子層面的深入探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 4周齡SPF級雄性Wistar大鼠40只，體重(100±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.1.2 藥物 Streptozotocin(SIGMA，美國，S0130-100)，鹽酸二甲雙胍(源葉生物，1105-70-4)

1.1.3 試劑及儀器 超純RNA提取試劑盒(康為世紀生物)，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀生物)，SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA Biosystems，美國)，AMPKα2抗體(Abcam，英國，ab3760)、NF-κBp65抗體(Abcam，英國，ab16502)，大鼠IL-6 Elisa試劑盒(Multisciences)。全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3,Thermo，美國)，熒光定量PCR儀(ABI7500，美國)，凝膠成像儀(Tanon-6600，中國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只大鼠適應性喂養于北京中醫藥大學東方醫院實驗動物中心SPF級動物房，溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，自由進食和飲水。1周后隨機取出6只作為空白組，其余34只給予高脂飼料(70%普通飼料、10%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供)喂養4周后，禁食12 h，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%濃度STZ。空白對照組腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液。3 d后，以空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L，視為造模成功。將成模大鼠隨機分為模型組、推拿組、西藥組及西藥推拿組。剔除造模失敗及干預中死亡的大鼠，最終各組取材大鼠分別為6只。

1.2.2 干預方法 空白對照組(Control Group，CON)：相同飼養條件下不做任何處理，但在其他組進行干預時，給予相同的鼠袋固定15 min，固定后給予1 mL蒸餾水灌胃，1次/d，共8周。疾病模型組(Model Group，MOD)：干預方法同空白對照組。西藥觀察組(Drug Group，MET)：將配置好的二甲雙胍水溶液，按照250 mg/(kg·d)灌胃給藥，并在灌胃給藥結束后用相同鼠袋進行固定，1次/d，共干預8周。推拿觀察組(Tuina Group，TNA)：將大鼠用鼠袋套住頭及胸部(黑暗環境有利于實驗大鼠狀態平靜，治療依從性高)，然后給予推拿干預。具體操作如下：以神闕為中心順時針揉腹5 min，三指振腹法于小鼠關元、神闕、天樞區域施術5 min，頻率(240±10)次/min，行彈撥法于大鼠雙側梁丘血海5 min，頻率(120±10)次/min。整套手法共計15 min，手法結束后給予1 mL蒸餾水灌胃，1次/d，共干預8周。西藥推拿組(Combined Group，MIX)：首先給予推拿組相同的手法干預，然后給予西藥組相同標準的二甲雙胍灌胃，1次/d，共干預8周。

1.2.3 組織標本采集及處理 大鼠在末次干預結束當天晚上9點，禁食不禁水12 h后，依次按0.7 mL/kg的劑量腹腔注射5%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血后處死，冰浴下(4 ℃冰盤)，取腹直肌并快速去除多余脂肪和結締組織后，放入凍存管內，投入液氮保存，處死動物。隨后將動物組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.4 指標檢測與方法 1)RT-PCR方法檢測AMPKα2、NF-κB及IL-6的 mRNA轉錄水平Trizol法提取大鼠腹直肌總RNA，取1 μg繼續反轉錄程序，得到cDNA溶液，存于-20 ℃備用。引物序列及產物長度見表1，以cDNA做模板，應用real-time PCR儀進行擴增，采用熔解曲線分析方法，首先對基因進行PCR擴增循環，待擴增循環完成后，依據熔解曲線對產物進行分析，以確定產物純度。采用相對定量法，以GAPDH作為內參基因，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

2)Western Blot測定AMPKα2及NF-κB蛋白表達水平取各組大鼠腹直肌組織，加入RIPA裂解液，徹底混勻。冰上孵育20 min后，13 000 r/min(4 ℃)離心20 min。取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度上樣，SDS-PAGE電泳，轉膜后，抗體孵育，ECL顯色，膠片曝光。最后，采用凝膠圖像分析系統對western blot蛋白雜交條帶進行掃描，并用Imagesystem 4.00軟件對圖像進行灰度分析。相對含量的變化=目的蛋白灰度/GAPDH。

表1 各引物序列及擴增產物大小

3)ELISA測定IL-6含量取各組大鼠腹直肌組織，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 對T2DM大鼠FBG水平的影響 干預前，模型組、西藥組、推拿組、西藥推拿組與空白組比較，FBG值顯著高于空白組，差異有統計學意義；西藥組、推拿組、西藥推拿組與模型組比較，差異無統計學意義。與模型組比較，西藥組FBG值在第2、4、8周時均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，推拿組FBG在第4、8周時顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，西藥推拿組FBG在第2、4、8周時均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；與西藥組比較，西藥推拿組在第4周時對FBG調節效應更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；與推拿組比較，西藥推拿組在第4、8周時對FBG調節效應更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；與0周時比較，各觀察組在第2、4、8周時，均可顯著降低FBG，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.2 對T2DM大鼠腹直肌AMPKα2、NF-κB、IL-6 mRNA轉錄及蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組AMPKα2mRNA轉錄及蛋白表達均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、推拿組、西藥推拿組AMPKα2mRNA轉錄及蛋白表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與西藥組及推拿組比較，西藥推拿組的AMPKα2基因轉錄有升高趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

表2 各組大鼠不同時段空腹血糖值

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與推拿組比較，□P<0.05；與0周比較，■P<0.05，■■P<0.05

圖1 各組不同時期FPG水平比較

組別AMPKα2mRNA轉錄蛋白表達空白組1.10±0.090.62±0.03模型組0.62±0.13*0.31±0.01*西藥組0.78±0.10△0.46±0.02△推拿組0.71±0.05△0.50±0.07△藥推組0.90±0.10△0.50±0.06△

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖2 推拿對各組腹直肌組織AMPKα2mRNA轉錄(A)、蛋白表達(B)及電泳結果(C)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表4 各組大鼠腹直肌NF-κB mRNA轉錄及蛋白表達

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖3 推拿對各組腹直肌組織中NF-κB mRNA轉錄(A)、蛋白表達(B)及電泳結果(C)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

與空白組比較，模型組NF-κBmRNA轉錄顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組NF-κBmRNA轉錄下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，推拿組NF-κBmRNA轉錄及蛋白表達均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥推拿組NF-κBmRNA轉錄顯著下降，差異有統計學意義(P<0.01)，蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與西藥組及推拿組比較，西藥推拿組NF-κBmRNA轉錄有下降趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖3。

與空白組比較，模型組IL-6 mRNA轉錄升高，差異有統計學意義(P<0.05)，蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、推拿組及西藥推拿組IL-6基因轉錄均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，蛋白表達均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.01)；西藥推拿組較其他兩觀察組對IL-6 mRNA轉錄及蛋白表達的調節效應更為顯著。見表5、圖4。

表5 各組大鼠腹部脂肪IL-6基因轉錄水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖4 推拿對各組腹部脂肪組織IL-6 mRNA轉錄和蛋白表達的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

中醫理論認為，脾在體合肌肉、主四肢，因此，我國歷代醫家尤其重視推拿與導引在“脾失健運”相關疾病中的防治作用，本次研究中運用到的核心手法——振腹法主要作用為培元固本，補益肝腎；輔以揉摩天樞以調暢氣機，溝通上下；點按梁丘、血海以健脾清胃，化痰降濁。近年來，推拿治療的疾病譜逐漸由原先的骨傷類疾病向內科慢病的方向回歸，在我國T2DM的防治領域推拿有著廣闊的應用前景。然而，國內外對于推拿改善T2DM的生物學機制研究尚處于起步階段，急需相應的基礎研究為推拿的臨床應用提供現代科學的理論依據。

近年來研究發現，慢性炎性反應參與了整個T2DM的發病過程，其程度與IR及β細胞損傷呈正相關。糖毒性不僅可直接引起外周組織慢性炎性反應，還可通過糖基化終末產物(Advanced Glycation End Products，AGEs)、UPR、己糖胺途徑(Hexosamine Pathway)、胰臟淀粉酶沉積、β細胞去分化等途徑間接引發組織慢性炎性反應[6]。而脂質的異位沉積引發的脂毒性，可招募炎性細胞浸潤，誘導OS、ERS及線粒體功能障礙等病理損傷也被認為是機體慢性炎性反應引起IR及T2DM發生發展的重要機制[7]。

NF-κB作為與免疫調控、介導炎性反應密切相關的核因子，廣泛分布于真核生物細胞中，細胞在靜息狀態下NF-κB的p50/p65亞基與抑制蛋白IκB以三具體形式存在于細胞質中。當受到TNF-α、IL-1β、IL-6及FFA等細胞因子或信號分子刺激后，與其抑制因子IκB解離，繼而進入細胞核與相應靶基因結合，發揮轉錄調節作用。在復雜的炎性反應細胞因子網絡中，NF-κB的活化或是其中的一個中心環節，調控著大量細胞因子之間的相互作用[8]。

當前，圍繞推拿的免疫調節機制方面的研究正呈現上升趨勢。有研究發現按摩可顯著提高小鼠的胸腺及脾臟的T淋巴細胞數量，并認為其可作為免疫缺陷相關疾病的輔助治療方法[9]。亦有學者在治療肥胖型2型糖尿病的臨床研究中，發現推拿聯合藥物治療可進一步改善血清炎性反應因子IL-6、TNF-α及CRP水平，使炎性反應水平得到控制[10-11]。本研究從基因與蛋白的層面均反映出了推拿對骨骼肌AMPKα2、NF-κB及IL-6的調節作用，且其對IL-6蛋白的抑制作用可在與二甲雙胍聯用后進一步加強。盡管有研究[12]表明二甲雙胍可通過肝臟AMPK途徑抑制IKKα和IKKβ表達，調節相關炎性反應因子，但在本研究中，二甲雙胍對骨骼肌NF-κB蛋白表達的抑制作用并不顯著。而推拿干預對骨骼肌NF-κBmRNA轉錄及蛋白表達有顯著的抑制作用，且在2種干預方式聯用的情況下仍存在這一效應。AMPK作為細胞能量代謝的“開關”，不僅能夠調節糖脂代謝，在抑制炎性反應中同樣扮演重要角色[13]。而推拿抗炎效應的產生是否由AMPKα2信號網絡介導，有待進一步實驗驗證；如果存在相關性，則推拿很有可能通過AMPKα2的下游分子SIRT1而對NF-κB合成產生抑制效應[14-15]。總之，當前的實驗結果為解釋推拿在大量T2DM臨床研究[16-18]中體現出的抗炎效應機制提供了重要的科學依據。

此外，從對FBG的調節程度來看，與單純西藥或推拿組比較，西藥聯合推拿組在整個干預周期內體現了更穩定的血糖調控效應。推拿組自身對照顯示降糖效應在4周時效果最好，在第8周時血糖值再次升高，這一現象或與老鼠的整體狀況隨病情進展而惡化有關，提示了推拿的獨立降糖能力有限，或更適用于輕、中度T2DM患者的臨床治療。但與模型組的比較仍可以看出，其改善機體炎性反應，減緩T2DM病情進展的作用是可以肯定的。

然而，本次研究仍存在一定的不足之處，如僅對AMPKα2與NF-κB的總蛋白表達進行了測定，在后續研究中應補充對其磷酸化蛋白水平的測定，以便于進一步明確推拿手法對這2個信號分子的活性是否存在調節作用。此外，Irisin[19-20]、LP、ADP、Chemerin[21-22]等肌肉及脂肪因子均存在對AMPKα2與NF-κB的上游調節作用，對這些因子的篩選，也將有利于完善推拿改善T2DM代謝性炎性損傷機制的科學假說。

綜上所述，本研究初步揭示了推拿可改善T2DM大鼠的FBG水平，增強骨骼肌AMPKα2基因轉錄與蛋白表達，同時降低骨骼肌炎性因子NF-κB及IL-6的基因轉錄與蛋白表達，其與二甲雙胍聯用可體現較好的協同降糖與抗炎效應。但NF-κB、IL-6與AMPKα2三者間的關聯性，仍有待進一步探索。