炎癥因子風暴對老年小鼠感染免疫應答的影響

袁松華，何涌泉，徐建青,2， 張曉燕,2*

(1.復旦大學附屬公共衛生臨床中心，上海 201508；2.復旦大學生物醫學研究院，上海 200032)

高致病性流感病毒H5N1[1]、H7N9[2]感染研究均提示重癥流感樣感染的重要特征是宿主體內免疫應答失調，出現腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素6(interleukin 6，IL-6)等炎癥因子以及白介素8(interleukin 8，IL-8)，C-C型趨化因子配體(C-C chemokine ligand 2，CCL2)等趨化因子過度表達，免疫學上定義為炎癥因子風暴[3]。出現炎癥風暴的宿主臨床癥狀表現為持續發熱，下調淋巴細胞，出現重癥肺炎、肺重癥損傷等嚴重的呼吸道癥狀，是臨床轉歸不佳的重要因素[4]。從免疫機制來說，炎癥風暴是調節免疫應答的關鍵因素[5]，主要誘發組織局部炎癥，直接損傷肺毛細血管粘膜，促使肺泡水腫和表面活性蛋白失活。失控的炎癥風暴會進一步彌散炎癥和肺泡結構的破損造成機體肺血氧不足，最終發展為急性呼吸窘迫癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[6-7]。

現有研究發現炎癥風暴盡管不是呼吸道病毒感染特異性的，但與宿主感染病毒后高致死率顯著正相關[8]。團隊前期研究發現老年感染者炎癥應答過度，以IL-6，IL-8為主要的炎癥、趨化因子高表達，肺內灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)內的炎癥因子濃度近乎外周1000倍以上[9]。另外通過老年感染者肺組織病理染色發現，肺泡細胞壁增厚，肺泡間隙進一步被壓縮，更多的炎性淋巴細胞趨化至病灶，造成多處不可逆損傷。成年小鼠的流感病毒(H1N1)感染模型已經證實[10]，流感病毒感染可有效誘發I型干擾素的迅速上調，炎癥因子前體的分泌進一步刺激了其他炎性因子表達上調，繼而激活樹突狀細胞、巨噬細胞、上皮細胞等。多種固有免疫細胞迅速被動員，參與抗病毒的炎癥應答，級聯放大炎癥應答。在流感病毒感染過程中，炎癥風暴如何影響老年感染者肺內免疫細胞應答的機制尚且沒有得到解析。因此，本課題組擬利用老年小鼠感染H9N2病毒的免疫模型，重現肺內炎癥風暴，從組織學和細胞學角度解析，對肺巨噬細胞、肺中性粒細胞等主要免疫細胞應答的影響，為回答流感病毒感染引發的炎癥風暴如何影響老年宿主臨床轉歸的科學問題提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 流感病毒

H9N2病毒經MDCK細胞和雞胚培養滴定后，-80℃儲存備用。實驗均在動物生物安全三級實驗室(ABSL-3)中進行。[高致病性病原微生物實驗室資格證書編號為衛BSL3-007；中國合格評定國家認可委員會實驗室認可證書編號NO.CNAS BL0016]，研究方法經過上海市公共衛生臨床中心動物倫理委員會審查(編號為：2014倫審K007號)。

1.2 實驗動物

實驗小鼠均選用SPF級別雌性C57小鼠，6～8周齡(18～19 g)和8月齡小鼠(22～24 g)(每種小鼠各30只)均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]，8月齡小鼠在上海市公共衛生臨床中心實驗動物部SPF區域[SYXK(滬)2015-0008]繼續飼養至18～24月齡(28～30 g)。

1.3 實驗方法

1.3.1 老年小鼠流感病毒感染方案

研究對象：受試小鼠提前24 h轉入生物安全實驗室適應，分為老年感染組、成年感染組、老年未感染對照組以及成年未感染對照組共計4大組，每組小鼠10只。小鼠腹腔注射100 μL 1%戊巴比妥鈉溶液全身麻醉，5×106EID50H9N2流感病毒經鼻腔攻擊，記錄各組小鼠感染后連續14 d的體重變化、生存情況。

1.3.2 石蠟切片免疫組化染色

將肺組織在10%的福爾馬林溶液，靜置固定24 h，包埋于石蠟中。蠟塊制備為10 μm切片(白片)數張備用。60℃烤片1 h，依此在二甲苯，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇依次浸泡脫蠟3～5 min，在檸檬酸鹽緩沖液沸水浴中抗原修復5 min， PBS溶液洗滌3次，血清室溫封閉20 min，加入相應的一抗anti-Macrophage(1∶100使用，克隆號：11H3，貨號：GTX53120)或Anti-Neutrophil Antibody(1∶100使用，克隆號：NIMP-R14，貨號：LS-C139871)，4℃孵育過夜后，PBS溶液洗去一抗后，室溫加入二抗孵育(HRP抗體)30 min，PBS溶液再次洗去二抗后，DAB溶液染色3～10 min，顯微鏡下觀察終止染色。自來水沖洗切片后，蘇木素溶液復染30 s，自來水再次洗去染液，晾干切片，封片。全部切片由奧地利TissueGnostics類流式組織定量細胞分析儀拍攝分析。

1.3.3 炎癥-趨化因子檢測

收集感染急性期內(第1、2、3、7天)小鼠肺內灌洗液和外周血，肺灌洗液4℃，12 000 r/min離心5 min，分裝上清，將外周血混入抗凝劑(3.8%枸椽酸鈉溶液與全血1∶9混合)重復混勻，3000 r/min離心10 min，分裝上清。分別取50 μL肺灌洗液、血漿和梯度稀釋后標準品，依次加入50 μL預混多因子磁珠，50 μL PE標記的熒光染色溶液，室溫避光孵育2 h。200 r/min離心5 min，用試劑盒內專用的洗滌緩沖液洗1次，每管終體積為100 μL。全部標本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細胞儀分析獲取數據。

1.3.4 肺內T淋巴細胞染色

收集感染后第7天的小鼠肺組織，含10%FBS的1640培養液洗滌2次，每只小鼠取2 g組織，無菌眼科剪處理成小于1 mm3組織小塊。消化液(含1%I型膠原酶和0.5%的DNase)37℃孵箱內處理3～5 h，組織完全消散。將細胞懸液經100 μmol/L無菌濾網獲得最終單細胞懸液。每個標本選取106單細胞懸液，anti-CD4(2D4)、anti-CD8(11C) 室溫避光染色10 min，含10%FBS的PBS染色緩沖液洗滌1次，500 r/min離心5 min，棄去上清，每管終體積為100 μL。全部標本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細胞儀分析獲取數據。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 感染H9N2病毒后，老年小鼠出現炎癥風暴，且集中在肺內局部

收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點的外周血。圖1a定量檢測了血漿中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ在血清中表達，除MCP-1表達量為100 pg/mL,其余因子均低于50 pg/mL。流感病毒H9N2是經鼻腔由呼吸道入侵宿主，因此進一步收集了收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點的肺泡灌洗液。動態分析結果顯示老年感染鼠肺內的炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1異常高表達，在感染后第2天達到峰值，超過4000 pg/mL，是成年對照峰值表達量的100～1000倍(圖1b)。另外，在肺內，不管是老年小鼠還是成年對照，均表達相近水平的炎癥因子TNF-α(峰值約1000 pg/mL)，且動態變化趨勢也一致，是兩組不同月齡小鼠感染H9N2病毒后共性的炎癥應答。本課題組還發現干擾素IFN-γ 在老年小鼠感染后第7天內表達上調，而成年對照則無應答。

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點的外周血。檢測血漿中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ。圖1a 老年小鼠感染H9N2病毒后，外周血中炎癥-趨化因子的表達情況Note.Peripheral blood of mice infected with H9N2 virus was collected for the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in plasma.Figure 1a Expression of inflammatory cytokines in the periphery blood of aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點的肺灌洗液。檢測灌洗液(BAL)中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ。圖1b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內炎癥-趨化因子的表達情況Note.Lung lavage fluid of mice infected with the H9N2 virus was collected on the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in BAL.Figure 1b Expression of inflammatory cytokines in the lung of aged mice infected with H9N2 virus

2.2 感染H9N2病毒后，老年小鼠肺巨噬細胞應答不足，中性粒細胞應答滯后

圖2a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內巨噬細胞的動態變化(×200)Figure 2a Dynamic changes in alveolar macrophages of the aged mice infected with H9N2 virus

注：組織類流式定量細胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進行圖像定量分析，每只小鼠肺組織切片標本隨機選取3張，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，測定每個視野下免疫陽性細胞密度(單位為每平方毫米的細胞計數)。與成年對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內巨噬細胞的定量分析Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer (Austrian Tissue Gnostics). Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field.Compared with adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 2b Quantitative analysis of alveolar macrophages in aged mice infected with H9N2 virus

利用免疫組化技術分析了急性感染期內(第1、2、3和7天)肺巨噬細胞的動態變化，帶有藍色細胞核灰褐色小圓型細胞樣結構被判定為陽性細胞。切片應用組織類流式定量細胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進行定量分析，測定每個視野下(圖2a，圖3a)免疫陽性細胞密度(單位為每平方毫米的細胞計數)。統計結果顯示發現H9N2感染后，老年小鼠的肺內巨噬細胞(圖2b)在感染后第1天迅速趨化，增殖，但是顯著弱于成年小鼠。感染后時間動態變化提示，肺內巨噬細胞在感染后第1天達到峰值，第2、3和7天逐漸減少。同時觀察免疫組化染色肺內原位中性粒細胞的應答情況。小鼠感染H9N2病毒后，肺內中性粒細胞(圖3b)在第1、2天增加，第2天達到峰值，然后在感染后第3至第7天逐漸減少。與巨噬細胞不同的是，老年小鼠在感染第1、2天顯著低于成年對照，而在感染后第3至第7天卻顯著高于成年對照。這樣的實驗現象提示，與成年對照相比，感染H9N2病毒的老年小鼠肺巨噬細胞應答不足，而肺中性粒細胞感染急性早期應答同樣不足，但在急性后期卻在肺內大量滯留。

圖3a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內中心粒細胞的動態變化(×200)Figure 3a Dynamic changes of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：組織類流式定量細胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進行圖像定量分析，每只小鼠肺組織切片標本隨機選取3張，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，測定每個視野下免疫陽性細胞密度(單位為每平方毫米的細胞計數)。與成年對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內中性粒細胞的定量分析(×200)Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer. Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field. Compared with the adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 3b Quantitative analysis of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第7天的肺組織，消化成單細胞，計數肺內總細胞數量。陰性分選肺內CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。分別計數后，計算CD4+T和CD8+T淋巴細胞占肺內總細胞的比例。與成年對照組比較，*P<0.05。圖4 老年小鼠感染H9N2病毒后第7天，肺內T淋巴細胞的數量和比例Note. Lung tissue of mice infected with H9N2 virus was collected at day 7, digested into single cells, and the total number of cells was counted. CD4+ and CD8+ T lymphocytes were negatively sorted. After counting, the ratio of CD4+ T and CD8+ T lymphocytes to the total cells in the lung was calculated. Compared with adult mice, *P<0.05。Figure 4 Number and proportion of pulmonary T cells in the aged mice at day 7 post-infection

2.3 感染H9N2病毒后第7天，老年小鼠肺內CD8+T淋巴細胞數量顯著減少。

在感染后第7天收集小鼠肺臟，肺臟在I型膠原酶消化液中解離成單個細胞懸液，對于肺內總細胞進行計數。分別使用StemCellTMCD4或CD8陰性磁珠分選試劑盒分選出對應的T淋巴細胞，分別進行計數。取其中部分細胞分別在表面染色標記CD4-FITC、CD8-PE，結果顯示陽性率大于95%(數據未展示)。統計結果(圖4)顯示未感染條件下，與成年對照相比，老年小鼠肺內CD4+、CD8+T淋巴細胞的數量和比例無顯著性差異。感染H9N2病毒后第7天，CD4+T淋巴細胞的數量和比例以及CD8+T淋巴細胞的比例則依然維持不變，而老年小鼠肺內CD8+T淋巴細胞的數量則顯著降低。

3 討論

本團隊前期臨床研究發現H7N9的老年感染者主要過量上調炎癥因子IL-6、趨化因子IL-8，另一種重要的炎癥因子TNF-α等卻沒有發現其表達上調。重癥感染后，免疫穩態的失衡，宿主體內產生炎癥風暴[9]。但IL-6、IL-8的分泌占據大部分的比例，是否抑制了其他炎癥通路的活化或是其他通路活化的負反饋，促進IL-6、IL-8因子的高表達。IL-10是一種通常意義的負向調控因子，主要功能是調節免疫平衡，防止免疫應答過度活化[11]。臨床研究中三名危重病人肺內灌洗液中檢出很少的IL-10因子表達，肺內炎癥因子選擇性暴增的機制目前沒有得到解析。老年小鼠感染H9N2病毒后，炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1同樣在小鼠肺內過量表達，老年小鼠肺內炎癥風暴主要以炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為主，峰值表達超過4000 pg/mL，而成年小鼠肺內炎癥因子TNF-α、IL-6表達上調，峰值表達500～1000 pg/mL。有意思的是，本課題組在感染后癥狀輕微的成年小鼠肺內灌洗液中檢測出負調控因子IL-10上調(數據未顯示)。老年小鼠感染H9N2后，與成年被感染小鼠相比，體重下降顯著，死亡率僅為50%。因此，高水平的炎癥因子風暴對應了重癥的臨床轉歸情況，與本團隊2013年度H7N9感染者臨床現象相符。

肺巨噬細胞是一群定居在肺組織內固有免疫細胞，對于維持肺組織免疫穩態具有關鍵作用[12]。與其他類型巨噬細胞明顯不同，肺巨噬細胞在原位自我更新[13]，而不是從遷徙來的單核細胞分化更新[14]。肺巨噬細胞主要參與靜息狀態下肺組織的損傷修復、宿主抵御系統性抗病毒或細菌的感染。小鼠感染H9N2流感病毒后，肺巨噬細胞結合出現凋亡的靶細胞且降解處理，其分子機制已經在體外細胞模型中報道，肺巨噬細胞表面高水平表達的CD204分子，是重要的肺內清除功能受體[15]。另外有報道發現衰老的肺巨噬細胞表面的CD204分子表達下降，與清除凋亡細胞功能的下降呈正相關[16]。本課題組的研究發現老年小鼠感染H9N2病毒后，肺巨噬細胞上調顯著低于成年對照。呼吸道病毒感染過程中，肺巨噬細胞主要是通過分泌I型干擾素招募炎癥單核細胞[17]。肺巨噬細胞不是唯一的肺內具有免疫吞噬功能的固有免疫細胞，樹突狀細胞以及被招募的單核淋巴細胞同樣承擔一系列的免疫吞噬能力。相對于年輕對照，感染H9N2病毒的老年小鼠肺內中性粒細胞的滯留更加嚴重。大量的中性粒細胞的富集在肺組織局部，進一步惡化了肺內炎性環境，造成更嚴重的肺損傷。肺內的高炎性環境招募中性粒細胞的侵潤，大量的中性粒細胞在肺內長時間滯留，又進一步上調炎癥因子，最終造成肺損傷。因此，老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內參與抗感染的固有免疫應答細胞種類沒有發生改變，但值得注意的是，巨噬細胞在肺內的數量出現顯著下降，中性粒細胞的遷徙能力同樣發生顯著減弱。

在流感病毒感染免疫過程中，相對于固有免疫應答，獲得性免疫應答是抗原特異的，由專職的抗原遞呈細胞進行抗原處理加工，因此免疫應答的發生時相要晚于非特異應答。在感染免疫應答期，感染H9N2的老年小鼠肺內輔助性T細胞的比例和數量，與成年小鼠相當。但有報道指出在致死性流感模型中，老年小鼠肺間質中定居的CD69+CD8+T細胞數量顯著下降[18]，這群特殊的細胞發現具有長時間生存能力，同時是抗流感病毒感染的重要T細胞亞群。本課題組研究同樣確認了重癥感染流感病毒的老年小鼠肺內CD8+T細胞的顯著減少，證實感染后特異性細胞殺傷應答的強度顯著降低，但具體屬于哪類亞群還需要進一步確認。

與其他年齡對照組相比，老年人群在重癥流感感染過程中有合并下呼吸道感染的風險。臨床上肺部聽診、C反應蛋白以及胸部射線檢查均提示老年流感重癥感染者具有較高的肺部感染發生率。本課題組前期建立的老年小鼠感染流感免疫模型已經確認老年宿主感染流感病毒后預后不佳。感染流感病毒后，老年小鼠肺內炎癥因子的異常高水平上調，導致肺巨噬細胞的應答下降，中性粒細胞遷徙能力減弱，過量表達的炎癥進一步下調了老年小鼠肺內CD8+T細胞，削弱了抗感染的細胞毒殺傷應答。因此，高水平的炎癥風暴直接或間接導致老年小鼠出現重癥的臨床轉歸，但肺內炎癥風暴如何調控肺內固有免疫細胞應答的分子學相關機制還有待于后續的研究。