氨基葡萄糖鹽酸鹽及其衍生物對斑馬魚骨骼損傷修復的比較研究

張文娟，許璟瑾，姚麗云，李秀敏，潘裕添，薛 鈺,2*

(1.閩南師范大學福建省菌類活性物質工程技術研究中心， 福建 漳州 363000；2.膜生物學國家重點實驗室，北京 100101)

氨基葡萄糖鹽酸鹽(glucosamine hydrochloride，GAH)又名葡糖胺鹽酸鹽，是天然氨基單糖衍生物之一，而氨基葡萄糖是軟骨基質中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1-2]。前期的研究結果表明， GAH對斑馬魚骨骼的發育及損傷有明顯的促進及修復作用。

而與GAH有類似結構的糖類及衍生物有很多，如：葡萄糖(glucose，Glu)；葡萄糖的同分異構體D-半乳糖(D-Galactose，Gal)；由葡萄糖的同分異構體甘露糖加氫而得到的甘露醇(manntiol，Man)；與GAH類似的氨基糖衍生物N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，NAG)[3-5]。本文以斑馬魚為模型，探索比較GAH及其衍生物對斑馬魚幼魚骨骼損傷修復及預防的效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

TU品系斑馬魚，由清華大學生命科學學院孟安明課題組惠贈。飼養于本課題組的斑馬魚水循環養殖系統中，斑馬魚的養殖和繁殖參照標準方法[6-7]。將性成熟(3月齡)的雌雄斑馬魚放入交配缸中，插入隔板；次日清晨撥開擋板待交配產卵，斑馬魚胚胎在受精后30 min內收集，洗滌后放入90 mm培養皿，加入Holfreter水(0.05 g/L KCl，0.1 g/L CaCl2，0.025 g/L NaHCO3，3.5 g/L NaCl)培養于28℃恒溫培養箱中，在體式顯微鏡下挑選發育正常胚胎，用于試驗。動物實驗遵循3R原則。

1.2 實驗藥物及儀器

本研究所用GAH藥物是從雙孢蘑菇中提取所得，與傳統從蝦蟹殼來源相比，避免了過敏、嘔吐等不良反應，擴大了適用人群。葡萄糖和甘露醇(AMRESCO)；D-半乳糖溶液(國藥集團)；N-乙酰葡萄糖溶液(上海源聚生物科技有限公司)；阿侖膦酸鈉片(默沙東制藥)；枸櫞酸鐵銨(Sigma，F5879-100G)。

AUY320日本島津電子分析天平(上海儀田精密儀器有限公司)；PYX-280-A生化培養箱(科力儀器有限公司)；ZD-9550轉移搖床(海門其林貝爾)；MS-H-S磁力攪拌器(武漢華科達實驗設備有限公司)；Nikon SMZ18體式熒光顯微鏡(日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 胚胎的藥物處理

以6孔板為實驗容器，每孔50枚胚胎，根據前期的實驗條件及已有的研究報道[8]，選用0.1%(1 mg/mL)的工作濃度，將斑馬魚受精后0.75 h的胚胎分別暴露在葡萄糖溶液(Glu)、甘露醇溶液(Man)、D-半乳糖溶液(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺溶液(NAG)和GAH溶液中，以未加藥組即Holfreter水培養為對照，每個處理組至少50枚胚胎，每12 h更換一次溶液，同時設置3個平行樣。觀察斑馬魚胚胎發育到36 h的生長狀況及死亡情況。

1.3.2 阿爾新藍和茜素紅染色

阿爾新藍染色是一種能夠特異性地染色軟骨細胞胞外基質的染料，發育生物學研究中一般使用該染色方法檢測胚胎骨骼的形成和軟骨的發育情況[9-10]。茜素紅能與骨骼中鈣離子以螯合方式形成復合物，可識別骨的鈣鹽成分，與骨中的鈣結節產生顯色反應，因此可用來檢測魚的骨形態和骨密度[11]。阿爾新藍和茜素紅染色方法參照文獻[12]。染色完成后，觀察斑馬魚骨骼的修復狀況，并拍照記錄。

1.3.3 不同藥物對斑馬魚骨質疏松癥的修復作用分組

收集48 hpf(hours post-fertilization)的斑馬魚幼魚，分為對照組(WT，正常的養魚水培養至第10天)；FAC組(500 μg/mLFAC培養至第10天)；Man組(FAC培養4 d，再換成0.1%甘露醇溶液培養4 d)；Glu組(FAC培養4 d，再換成0.1%葡萄糖溶液培養4 d)；NAG組(FAC培養4 d，再換成0.1% N-乙酰葡萄糖胺溶液培養4 d)，Gal組(FAC培養4 d，再換成0.1%半乳糖溶液培養4 d)；GAH組(FAC培養4 d，再換成0.1% GAH培養4 d)，共7組。對培養10 d的7組幼魚進行阿爾新藍染色和茜素紅染色。

1.3.4 GAH和阿倫膦酸鈉對骨質疏松癥的預防作用分組

收集24 hpf的斑馬魚胚胎，分成 4組，分別為對照組(CTR)：正常的養魚水培養至第10天；CTR+FAC組：先用H2O培養5 d，再用500 μg/mLFAC培養4 d；AL+FAC組：先用0.1%AL培養5 d，之后用FAC培養4 d；GAH+FAC組：先用0.1% GAH培養5 d，再換成FAC培養4 d。對培養10 d的4組進行茜素紅染色。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 相同濃度下不同藥物對斑馬魚胚胎發育的影響

與對照組相比，半乳糖與N-乙酰葡萄糖胺溶液的斑馬魚胚胎死亡率最高，且發育有明顯的延緩；葡萄糖與甘露醇對斑馬魚胚胎的影響較小，與對照組的死亡率基本相同，發育速度正常；GAH的死亡率為22%，發育正常且一致。總體分析對斑馬魚胚胎發育影響的大小依次為葡萄糖<甘露醇

圖1 相同濃度的不同樣品對斑馬魚胚胎死亡率的影響(n≥50)Figure 1 Embryo mortality rate at the same concentration of various agents

2.2 不同藥物對斑馬魚骨質疏松癥的修復作用

2.2.1 對軟骨損傷的修復比較

通過阿爾新藍染色檢測不同處理組的軟骨發育狀況，與FAC組相比，Man組和Glu組染色基本一致，其骨骼染色沒有變化；Gal組和NAG組，在副蝶骨、角舌骨、腭方骨及角鰓骨等部位的染色與Glu組和Man組相比加深，且Gal組比NAG組的染色更深；而GAH組的整個頭部骨骼染色明顯加深，與對照組較為接近。(圖2a～g)

統計分析結果顯示，Glu組、Man組、NAG組的染色面積與FAC組相比差異無顯著性(P> 0.05); Gal組的染色面積顯著性增加(P< 0.01); GAH組的染色面積極顯著增加(P< 0.001)，表明GAH對斑馬魚軟骨的損傷修復效果最好。(圖2 h)

注：(ch)角舌骨；(ps)副蝶骨；(mk)麥柯耳軟骨；(hm)舌骨下頜弓；(pq)腭方骨；(cbr1-5)角鰓骨；(op)孔蓋；(nc)脊索；(ot)耳石。與FAC組比較，**P< 0.01，***P < 0.001。圖2 不同糖類對FAC誘導的骨質疏松模型斑馬魚軟骨的修復作用(Bar=100 μm)Note. ch: Ceratohyal; ps: Parasphenoid; mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula; pq: Palatoquadrate; cbr1-5: Ceratobranchia; op: Operculum. nc: Notochord. ot: Otolith.Compared with the FAC group，**P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 2 Effect of various agents on the cartilage developmental defects induced by FAC

2.2.2 對硬骨損傷的修復比較

通過茜素紅染色觀察骨密度及骨形態，結果表明：與FAC組相比，Man組和Glu組的基本一致，染色都在其頭部的脊索和匙骨稍有加深；Gal組與NAG組的副蝶骨、角舌骨、麥柯耳軟骨及匙骨等部位的顏色比Glu組和Man組深；而GAH組的恢復效果最為顯著，整個頭部的骨骼染色與對照組接近，并且明顯能看到兩節脊椎。(圖3 a～g，)

統計結果顯示，與FAC組相比，Glu組、Man組、NAG組的染色面積無顯著性差異(P> 0.05); Gal組的染色面積顯著性增加(P< 0.01); GAH組的染色面積極顯著增加(P< 0.001)。

骨密度的變化趨勢與染色面積的變化趨勢一致。由此說明，GAH對斑馬魚的骨骼損傷修復效果最好，同時，在后期藥物修復的過程中，GAH組死亡率為零，而Gal組與NAG組陸續出現死亡，側面反映了GAH的藥效溫和。(圖3 h～i)

2.3 不同藥物對骨質疏松癥的預防作用

與CTR組相比，其它三組的染色深度有不同程度的減弱。CTR+FAC組中的副蝶骨和脊索的染色信號顯著減弱；匙骨、孔蓋和鰓條骨等部位的染色區域也明顯減小。AL+FAC組的斑馬魚頭部染色整體變淺，染色面積也顯著減少，且有明顯的殘留藥物(FAC)，只有匙骨、脊索和孔蓋可見染色信號。而在GAH+FAC組中的麥柯耳軟骨、軟骨內成骨、孔蓋、鰓條骨、舌骨下頜弓和脊椎骨都清晰可見，尤其是匙骨和脊索的染色強度與對照組非常接近，說明經GAH處理后，可明顯減緩FAC引發的骨損傷。(圖4)

3 討論

斑馬魚是一種優良的骨骼研究動物模型，它與人類在骨骼發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，與其他的動物模型相比，具有個體小適合高通量化學篩選、幼魚身體透明易于觀察骨骼發育的特點，所以近年來以斑馬魚為模型的骨骼研究逐漸成為這一領域的熱點[16-17]。斑馬魚的骨骼發育是一個從頭到尾的進程，其整個脊椎發育完成需要23 d左右。本研究對發育至第10天的斑馬魚幼魚進行骨骼染色，此時其顱骨已基本形成，脊椎應發育至第9脊椎，當用藥物(FAC)處理后，本該在此時期形成的骨骼出現缺失，導致一系列檢測指標下調，與Zhang等[18]報道的骨質疏松癥表型一致。

實驗結果表明，對斑馬魚胚胎發育影響的大小依次為：葡萄糖<甘露醇

GAH對FAC引起的損傷有一定的預防作用，優于阿侖膦酸鈉片。同時，在AL+FAC組處理過程中出現了較高的死亡率，且后期染色有明顯殘留物，說明在正常狀態下服用阿侖膦酸鈉，不僅不能起到預防骨質疏松的作用，反而對正常的機體有損害，此結果為未來GAH作為保健品開發，用于骨質疏松預防提供了初步的實驗支撐。

注：(a～g)斑馬魚頭骨染色的腹面觀；(a’～g’)斑馬魚頭骨染色的側面觀；(mk)麥柯耳軟骨；(hm)舌骨下頜弓；(op)孔蓋；(cl)匙骨；(ps)副蝶骨；(oc)枕骨;(ch)角舌骨；(bs)鰓條骨；(ot)耳石；(nc)脊索；(spine)脊椎骨。與FAC組比較，**P< 0.01，***P < 0.001。圖3 不同糖類對FAC誘導的骨質疏松模型斑馬魚骨骼修復作用的比較(Bar=100 μm)Note. (a-g) Ventral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (left column). (a′-g′) Lateral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (right column). Note. mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula. op: operculum; cl: Cleithrum; ps: Parasphenoid. oc: Occipital; ch: Ceratohyal; bs: Branchiostegal; ot: Otolith; nc: Notochord. Compared with the FAC group， **P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 3 Effect of the various agents on bone developmental defects induced by FAC in larvae

注：(mk)麥柯耳軟骨；(en)軟骨內成骨；(ps)副蝶骨；(nc)脊索；(cl)匙骨；(op)孔蓋；(spine)脊椎骨；(bs)鰓條骨；(hm)舌骨下頜弓。圖4 GAH對骨質疏松的預防作用(Bar=100 μm)Note. Note. mk: Meckel’s cartilage; en: Entochondrostosis; ps: Parasphenoid; nc: Notochord; cl: Cleithrum; op: Operculum; bs: Branchiostegal; hm: Hyomandibula.Figure 4 Preventive effect of GAH on osteoporosis