氟西汀對卒中后抑郁模型大鼠的行為及海馬神經元新生的影響

李愛平，田 靜，周芝文，楊期明，周文勝

(湖南省人民醫院神經內科，長沙 410016)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后常見的神經精神并發癥，其患病率逐年升高[1]，并且至少1/3患者在缺血性腦卒中后會出現心境改變[2]。現代醫學認為，PSD是各種神經生物學和社會心理因素綜合作用的結果[3-4]。研究發現，抑郁癥患者或動物模型存在海馬神經元再生減少、海馬體積變小，而且抗抑郁藥物可以增加海馬神經元再生[5]，提示海馬神經元的再生障礙可能也參與了PSD的發生。本研究將建立PSD大鼠模型，并觀察大鼠的行為學變化及其海馬齒狀回神經元的新生情況，探索氟西汀對PSD模型大鼠的治療作用及生物學機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠40只(SPF級)，體重240～260 g，購于湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]，動物實驗在湖南省人民醫院老年醫學研究所動物實驗室進行[SYXK(湘)2015-0013]。福利倫理審查號(倫審科2016第006號)，按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氟西汀購于大連美侖生物技術有限公司(產品編號：MB1555)。MCAO硅膠栓線購于廣州佳靈生物技術有限公司(產品規格：L3600)。微小染色體維持蛋白2抗體(Anti-MCM2 Antibody) 購于武漢博士德生物有限公司(產品編號：BM4086)。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組

在室溫(20 ± 2)℃和相對濕度為50% ～ 60%的條件下適應性飼養大鼠一周，大鼠自由進食和飲水，予以人工12 h晝夜循環照明(7:00 ～ 19:00光照)，隔日定時清潔籠舍。期間測定敞箱試驗(open field test, OFT)、蔗糖偏愛試驗(sucrose preference test, SPT)基線評分。篩選符合條件(OFT基線評分為30～ 120分)的大鼠40只隨機分成2組：手術組(n=32)和假手術組(n=8)。手術組行大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)術，術后24 h評分≥1分且<4分(按照Longa等[6]標準)的大鼠24只再隨機分成3組：卒中組(n=8)，每籠3～4只飼養；PSD 組(n=8)，MCAO術后第2天加以慢性不可預見溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)結合獨籠飼養；氟西汀組(n=8)，MCAO術后第2天即開始CMUS刺激結合獨籠飼養，自第15天起每日一次腹腔注射氟西汀(劑量為5 mg/kg體重)[7]進行干預，共用藥3周。假手術組除不插入栓線外，其他處理同卒中組。

1.3.2 PSD模型建立

首先參照Longa等[6]方法建立永久性MCAO模型，術中參照包新杰等[8]研究結果確定插入栓線深度為(18±1)mm。MCAO術后第2天,參照Willner[9]和Katz[10]報道的CUMS方法給予應激：①禁食禁飲20 h；②禁飲17 h；③45°斜置鼠籠17 h；④持續照明17 h；⑤濕籠(100 g墊料+200 mL水)21 h；⑥4℃水強迫游泳5 min；⑦水平震蕩鼠籠5 min；⑧行為約束2 h；⑨夾尾1 min，以上9種應激每天隨機采取一種，并采用單籠飼養。

1.3.3 行為學評價

各組大鼠術前基線期(0 d)及術后第7、14、21、28和35天分別測量體重，并進行SPT和OFT，而強迫游泳試驗(forced swim test，FST)僅在第35天末次應激后進行。

(1)蔗糖偏愛試驗 借鑒Willner等方法[9]加以改進。首先予1%蔗糖水飼養48 h，再禁水4 h，然后暴露1 h于兩個完全相同的瓶子(一個盛滿1%蔗糖水，另一個盛滿普通飲用水)。測定此1 h內蔗糖水消耗體積與總消耗體積(蔗糖水+飲用水)的比值。

(2)敞箱試驗 參照Papp等方法[11]所用敞箱長寬均為 80 cm、高為40 cm，內空的立柱體，壁周為黑色，底面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動物穿越地面方塊數(四爪跨入)作為水平活動得分，以直立次數(兩前肢離地l cm 以上)為垂直活動得分，記錄5 min。室內隔音，每次實驗后均需將動物排泄物清除干凈。

(3)強迫游泳試驗 參照Porsolt等方法[12]，試驗前1天將大鼠籠敞開飼養，第2天將大鼠放入一個盛水[(24±1)℃，45 cm深]的圓柱狀筒內持續10 min，游泳過程用攝像機拍攝記錄。觀察最初5 min，累計大鼠在水中不動、游動或攀爬狀態的時間。

1.3.4 免疫組化

行為學試驗結束后，用10%水合氯醛按3 mL/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，先后用4℃生理鹽水及含1%蔗糖的1%多聚甲醛(PFA)進行灌注，取腦于含1%蔗糖的1%PFA固定3 h，再移入4℃30%蔗糖溶液置冰箱中脫水沉底，制備海馬冠狀位冰凍切片(厚度20 μm)。取每只大鼠海馬組織結構最清楚的3張冰凍切片進行微小染色體維持蛋白2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)免疫組化染色，在400倍顯微鏡下，隨機選取五個視野，計算每個視野的MCM2陽性細胞數，然后取其平均值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 體重的變化

各組大鼠在術前體重基線值無統計學差異(P>0.05)。在實驗觀察期內，假手術組大鼠體重隨飼養時間延長而緩慢增加，而卒中組、PSD組和氟西汀組大鼠體重在手術后前14天內呈下降趨勢，自第21天時開始體重逐漸增加，其中卒中組和氟西汀組大鼠的體重增長速度較PSD組大鼠明顯增快。與卒中組比較，PSD組大鼠的體重在第21、28和35天時均有統計學差異(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠的體重在第21、28和35天時均有統計學差異(P<0.01)(見表1)。

2.2 蔗糖偏愛試驗

各組大鼠蔗糖水消耗比例術前基線水平無統計學差異(P>0.05)；MCAO術后第14、21、28、35天時，與卒中組比較，PSD組大鼠蔗糖水消耗比例均顯著減少(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠的蔗糖水消耗比例在第21、28和35天時顯著增加(P<0.05)(見表2)。

2.3 敞箱試驗

各組大鼠術前水平運動評分基線值無統計學差異(P>0.05)；與卒中組比較，PSD組大鼠水平運動得分在第21、28和35天時顯著下降(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀干預后大鼠在第21、28和35天時水平運動得分明顯增加(P<0.05)(見表3)。

各組大鼠術前垂直運動評分基線值無統計學差異(P>0.05)；與卒中組比較，PSD組大鼠垂直運動得分在第28和35天時明顯下降(P<0.05)；與PSD組比較，氟西汀干預后大鼠在第28和35天時垂直運動得分顯著增加(P<0.05)(見表4)。

2.4 強迫游泳試驗

與假手術組、卒中組比較，PSD組大鼠的不動時間顯著增加(P<0.01)，游動及攀爬時間顯著縮短(P<0.01)；與PSD組相比，氟西汀干預后大鼠不動時間顯著縮短(P<0.01)，游動時間顯著增加(P<0.01)(見表5)。

2.5 海馬齒狀回新生神經元的變化

采用免疫組化方法檢測大鼠海馬齒狀回區MCM2的表達，分析海馬中新生神經元增生的變化。結果顯示，在大鼠海馬結構中，可見MCM2主要表達于細胞核，MCM2陽性細胞局限于顆粒細胞層和門區之間的顆粒細胞下層，一般不會超過顆粒細胞層內1/3(見圖1)。與卒中組比較，PSD組大鼠海馬齒狀回的MCM2陽性細胞數顯著減少(H=109.30和P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠海馬齒狀回的MCM2陽性細胞數顯著增加(H=149.74,P<0.01)(見圖2)。

表1 各組大鼠不同時間點的體重變化Table 1 Weight changes of the rats in each group at various time points

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表2 各組大鼠不同時間點的蔗糖水消耗比例Table 2 Volume ratio of sucrose water consumption of the rats in each group at various time points

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表3 各組大鼠在敞箱試驗中不同時間點的水平運動得分Table 3 Comparisons of horizontal movement scores in the open field test of rats in each group

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表4 各組大鼠在敞箱試驗中不同時間點的垂直運動得分Table 4 Comparisons of vertical movement scores in the open field test of rats in each group

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：a：大鼠海馬齒狀回；b：黑色箭頭示MCM2+細胞。圖1 大鼠海馬齒狀回MCM2陽性細胞的表達定位Note. a: Hippocampal dentate gyrus of rats; b: MCM2+ cells (black arrow).Figure 1 Localization of MCM2+ cells in the hippocampal dentate gyrus of rats

組別Groups不動時間(s)Immobility time游動時間(s)Swimming time攀爬時間(s)Climbing time假手術組Control group40.50±7.82*120.25±8.24*139.25±11.55*卒中組Stroke group44.63±10.76*119.38±12.81*136.00±22.30*PSD組PSD group108.63±14.4686.75±10.51104.63±13.42氟西汀組Fluoxetine group50.25±13.09*132.12±16.48*117.63±11.60

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：與假手術組比較，#P<0.01；與卒中組比較，△P<0.01；與PSD組比較， ※P<0.01。圖2 大鼠海馬齒狀回MCM2陽性細胞的數量對比Note. Compared with the control group, #P<0.01; compared with the stroke group, △P<0.01; compared with the PSD group, ※P<0.01.Figure 2 Comparisons of MCM2+ cell numbers in the hippocampal dentate gyrus of rats in each group

3 討論

PSD是腦卒中后出現的一種精神情感障礙，它是卒中后腦部特定功能結構的損傷以及各種心理和社會應激的共同結果。本實驗首先通過線栓法制備腦缺血卒中模型，再運用孤養法及CMUS法聯合模擬卒中后的負性壓力環境制備PSD模型大鼠。該模型廣泛應用于PSD發病機制和藥物療效評價研究，其原理是嚙齒類動物在經歷一系列CMUS應激后，會出現快感缺失、興趣及運動下降、探索行為下降等抑郁行為特征[13-14]。

體重減輕是CMUS模型大鼠的重要特征之一，其原因可能是由于大鼠情感抑郁、食欲下降導致體重增加緩慢，但也可能是應激過程中采用了禁食禁水刺激，直接導致體重增加緩慢[15]。因此，體重的減輕可以反映應激事件對大鼠的負面影響，但不能作為衡量PSD大鼠模型建立是否成功的標準。SPT是根據大鼠對甜味的偏好而設計的一種檢測方法，反映了大鼠體驗快樂的能力，常用來評價抑郁大鼠的快感缺失癥狀[9]。OFT是反映大鼠對未知環境的探索能力及情緒反應的經典實驗，主要評價抑郁大鼠對外界的探索行為和好奇心下降等癥狀[11]。FST通過評估大鼠在游泳中出現的靜止不動、游動或攀爬三種狀態，反映大鼠的悲觀絕望樣行為特征[12]。但也有一些學者認為，強迫游泳試驗中動物的靜止狀態可能只是一種適應或疲勞現象，而不是真正的絕望行為[16]。因此，本實驗采用體重變化、SPT、OFT和FST等四個指標來綜合評估PSD大鼠模型的建立及氟西汀的干預作用。

本實驗發現，PSD模型大鼠在CMUS應激后第7、14天時體重下降幅度較卒中組大鼠無統計學差異，但在第21、28和35天時體重的增加較卒中組大鼠明顯減慢，提示隨著應激事件的累積，PSD模型大鼠的體重增長受到了負面影響，該結果與既往研究報道一致。而與卒中組大鼠比較，PSD模型大鼠的蔗糖水消耗比例(第14、21、28、35天)、OFT中的水平運動得分和垂直運動得分(第28和35天)均顯著下降，而且在CMUS后第35天進行的FST顯示PSD模型大鼠的不動時間顯著延長、游動及攀爬時間顯著縮短。以上結果顯示，CMUS刺激累積一段時間后，PSD模型大鼠表現出來的抑郁樣行為特征越來越顯著，也表明PSD大鼠模型建立成功。此外，與PSD組大鼠比較，氟西汀干預后的PSD模型大鼠的體重、蔗糖水消耗比例、水平運動和垂直運動得分、游泳中的不動時間均有明顯改善，說明氟西汀能改善PSD模型大鼠的抑郁癥狀。

MCM2蛋白是一種基因復制相關蛋白，存在于細胞核，是檢測海馬神經元新生的常用標記物[17]。本實驗結果顯示，經歷MCAO術的大鼠海馬齒狀回MCM2陽性細胞數明顯增加，可能是急性卒中應激誘發了海馬神經元新生和重塑；但CMUS聯合孤養應激后，大鼠海馬齒狀回的MCM2陽性細胞數增幅明顯下降，并且氟西汀的干預可以部分逆轉這種下降趨勢。既往研究報道，5-羥色胺1A受體(5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1A)能介導5-HT對海馬齒狀回的神經重塑起促進作用，5-HT缺乏可引起海馬齒狀回神經發生速度下降，進而促發抑郁[18-19]；PSD患者大腦皮層中5-HT和去甲腎上腺素能(norepinephrine，NE)遞質水平降低、邊緣系統和中縫核5-HT代謝速度顯著減慢、腦脊液中5-HT的代謝產物明顯下降[20-22]，PSD模型大鼠的額葉和海馬區5-HT和NE含量也明顯降低[23-24]，并且使用5-HT和NE再攝取抑制劑對PSD治療有積極作用[21,24]；也有學者認為，腦卒中相關的炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)增多導致腦內5-HT的耗竭，從而導致PSD發生[25]。因此，5-HT及其相關代謝通路在PSD的發病過程中起重要作用。氟西汀是一種選擇性5-HT再攝取抑制劑，臨床上常作為抗抑郁治療的一線用藥。本實驗結果顯示，氟西汀可以顯著改善PSD模型大鼠的抑郁樣行為，并且促進海馬齒狀回的神經元再生，這與另一種選擇性5-HT再攝取抑制劑(艾司西酞普蘭)類似[26]，但后者的抗抑郁作用起效更快，可能是因為對海馬區神經再生的影響更快[27]。綜上所述，海馬齒狀回的神經再生障礙可能是PSD發病的重要機制之一，同時也可能是氟西汀等抗抑郁藥物作用的遠隔效應，但其具體機制仍有待從顯微形態學、神經營養、信號傳導等方面深入研究。