不同方法誘導(dǎo)大鼠非酒精性單純性脂肪肝模型的CYP酶活性比較研究

金 毅，邢 偉，呂愛貞，張金龍，楊 雯，徐愉林，王 茜，李 靜

(1.深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫(yī)療器械檢測中心)深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057；2.廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523000)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及相關(guān)肝硬化和肝細胞癌[1-2]。隨著發(fā)病率的增加和年輕化趨勢，已成為全球重要的公共健康問題。NAFL被認為是早期病理過程，發(fā)展為肝硬化和肝癌的比例分別為5%～10%和1%～2%[1,3-4]。

目前國際公認的NAFL指標中，肝臟組織學(xué)表現(xiàn)符合單純性脂肪肝診斷標準即可診斷，其病理特征主要為肝腺泡3區(qū)大泡性或以大泡為主的混合性肝細胞脂肪變[1, 5-8]。

肝臟是藥物體內(nèi)代謝的重要器官，而細胞色素P450酶(CYP450)是參與藥物Ⅰ相代謝反應(yīng)的主要超家族酶系，廣泛參與脂肪酸、類固醇、膽酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及類維生素等物質(zhì)的生物合成和代謝，與內(nèi)外源性的物質(zhì)代謝密切相關(guān)[9]。通過評價NAFLD模型大鼠體內(nèi)CYP酶活性，對研究脂肪肝等肝疾病及合理用藥治療肝病具有潛在意義。CYP450酶系已明確的有18個家族，43個亞家族。參與藥物代謝的家族主要有CYP1，CYP2和CYP3，其中CYP1A2、2B6、2C9、2D6和3A4共同參與了約95%以上的經(jīng)CYP酶催化的臨床藥物的代謝。在肝硬化模型中大鼠的肝微粒體CYP總量明顯降低，肝損傷大鼠模型中CYP3A基因表達量會減少等幾種亞酶活性變化情況，但是，未找到CYP1A2、2B6、2C9、2D6和3A4活性變化在NAFL動物模型研究數(shù)據(jù)[10-13]。

國內(nèi)外研究CYP450酶活性的方法有很多，主要包括體內(nèi)和體外兩大方面。其中體外的研究方法有肝微粒體孵育法、肝S9孵育法、藥物探針法等。肝微粒體和肝S9均是肝細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的亞細胞組分，含有豐富的藥物代謝酶P450酶，是肝勻漿液經(jīng)過不同離心速度得到的組分。與肝微粒體制備對比，肝S9所需的離心速度較低，是肝勻漿液去線粒體的上清液，組分中含有的代謝酶種類也更多，包括各種I相代謝酶和II相代謝酶，添加NADPH(還原型輔酶II)，可以檢測I相代謝酶。目前肝S9系統(tǒng)在藥代動力學(xué)方面、毒理學(xué)和藥物相互作用等方面應(yīng)用比較廣泛[14]。

鑒于目前尚未見對CCl4或高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型CYP酶活性方面的比較研究報道，本研究采用大鼠肝S9孵育體系法探討CCl4和高脂模型2種因素誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中主要CYP酶活性的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：43004700035137，生產(chǎn)許可證號[SCXK(湘)2016-0002]；動物使用許可證號[SYXK(粵)2014-0135]。動物飼養(yǎng)于廣東東陽光藥業(yè)有限公司東陽光研究院屏障環(huán)境動物實驗室，在20℃～26℃溫度和40%～70%濕度下飼養(yǎng)，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，嚴格按照SPF級動物實驗室標準操作規(guī)程(SOP)規(guī)范操作[15](實驗動物福利倫理審查號 IAEC-K-170712-01)。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料(為自擬高脂飼料配方，具體成分為：基礎(chǔ)飲料：50%，豆粉：12.5%，蛋黃粉：12.5%，豬油：10%，蔗糖：10%，奶粉：5%，濃魚肝油：1/100 g。委托廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心配制)；非那西汀購自阿拉丁(批號：WXBC1218V)、雙氯芬酸鈉(批號：100334-200302)購自中國食品藥品檢定研究院；丁呋洛爾購自TRC(批號：1-EJB-67-6)、安非他酮(批號：100671-200301)購自中國藥品生物制品檢定所，紫杉醇(批號：130326)購自上海康標化學(xué)有限公司，0.01 mol/L Tris-HCL緩沖鹽(批號：批號ST774)購自碧云天。色譜純甲醇與乙腈購自SPECTRUM，色譜純甲酸和甲酸銨購自阿拉丁，其余試劑為色譜純，其余試劑詳見參考文獻[15]。

IKA T10B 手持勻漿機(德國IKA公司)；冷凍研磨儀(上海靜信實業(yè)發(fā)展有限公司)；Eppendorf 5810R冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；AB sciex 4500質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；其余儀器見[15]。

1.3 實驗方法

1.3.1 兩種大鼠NAFL模型的建立

實驗動物分為CCl4模型組和溶媒組，CCl4模型組大鼠每周2次皮下注射CCl4(40%，四氯化碳溶于橄欖油)，給藥量為2 mL/kg，溶媒組平行處理，背部皮下注射橄欖油，直至實驗結(jié)束。用于實驗4周，6周和9周剖殺的CCl4模型組和溶媒組動物數(shù)量分別為：5只，5只；5只，5只；10只，10只。

高脂模型組及空白對照組，每組各10只。高脂模型組每天給予高脂配方飼料，空白對照組給予正常飲食喂養(yǎng)。

根據(jù)筆者前期多次實驗確認皮下給予CCl4造模4周造模成功，故設(shè)置的第一個時間點為4周；文獻中，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠實驗多選擇8周確認造模成功，根據(jù)筆者經(jīng)驗，將高脂飼料造模的時間點設(shè)置為9周，以便與CCl4模型形成相似的肝細胞脂肪變性為主的病理學(xué)改變，在病理基本相近或相似的基礎(chǔ)上比較肝臟微粒體CYP酶活性變化特點[16-17]。此外，考慮主要實驗?zāi)康募爸芷冢瑸橛^察CCl4模型在不同時間點CYP酶活性特點，本課題組把CCl4模型實驗的結(jié)束時間點設(shè)置為9周。

實驗結(jié)束時，大鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉，處死。

1.3.2 大鼠肝S9制備

分別于CCl4造模4周、6周、9周，高脂造模9周，取邊長3 mm的新鮮肝組織，用冰水冷卻的生理鹽水沖洗凈，保存于-80℃，用于制備肝S9。

制備肝S9時，稱取500 mg大鼠肝組織于5 mL離心管中，于冰上剪碎肝組織，按1∶3(W∶V)比例加入勻漿液(0.25 mol/L蔗糖、0.01 mol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH=7.4)，用手持勻漿機于冰上以6000 r/min勻漿1 min，將勻漿后的混合液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，9000 r/min，4℃離心30 min，每管取200 μL上清液用于實驗[12]。

1.3.3 肝S9體外溫孵孵育系統(tǒng)條件

肝S9體外溫孵優(yōu)化后系統(tǒng)包括30 μL大鼠肝S9(對上述制備的S9用磷酸鉀緩沖液稀釋100倍)，15 μL探針底物溶液(1A2底物非那西汀濃度120 μmol/L、2B6底物安非他酮濃度40 μmol/L、2C9底物雙氯芬酸鈉濃度40 μmol/L、2D6底物丁呋洛爾濃度40 μmol/L、3A4底物睪酮濃度320 μmol/L)預(yù)孵10 min，于各孔加入15 μL 8 mmol/L NADPH，37℃(pH=7.4)共孵育45 min后，加入150 μL乙腈(含100ng/mL普萘洛爾)終止反應(yīng)，4000 r/min，4℃離心5 min取上清100 μL加水100 μL混勻，用于樣品分析。

1.3.4 檢測條件

色譜柱：ACE Excel3 C18-Amide(50×2.1 mm)，流速0.4 mL/min，柱溫40℃，A相(水+2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)，B相(甲醇+2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)，梯度為B相0～0.8 min，2%～2%；0.8～1.0 min，2%～85%；1.0～2.8 min，85%～90%；2.8～2.9 min，90%～2%；2.9～3.8 min，2%～2%。ESI+(電噴霧離子源)，霧化氣(N2)壓力55 psi，源溫度550℃。選擇正離子方式檢測，檢測電壓5500 V，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進行定量。內(nèi)標普萘洛爾離子對(Q1/Q3)為260.2/116.1、1A2探針底物代謝物Q1/Q3為152.1/110.0、2B6探針底物代謝物Q1/Q3為256.1/238.0、2C9探針底物代謝物 Q1/Q3為312.0/231.2、2D6探針底物代謝物 Q1/Q3為278.4/186.3、3A4探針底物代謝物 Q1/Q3為305.0/269.2。

1.3.5 ALT，AST檢測

腹主動脈采血，室溫放置2 h后4℃、3000 r/min，離心15 min，取血清，采用常規(guī)生化方法檢測ALT、AST。

1.3.6 肝臟甘油三酯及膽固醇的檢測

剪取新鮮肝臟部分左大葉，稱取約20 mg肝組織，用無水乙醇勻漿，離心取上清，測TG及CHO的濃度，計算肝內(nèi)TG及CHO的含量，詳見參考文獻[15]。

1.3.7 組織病理學(xué)檢查

福爾馬林固定肝組織，7 d。常規(guī)脫水浸蠟后，HE染色制片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

注：A：溶媒組肝臟(4周)；B：CCl4模型組肝臟(4周)；C：CCl4模型組肝臟(6周)；D：CCl4模型組肝臟(9周)。圖1 CCl4誘導(dǎo)的NAFL模型大鼠在4，6，9周的組織病理學(xué)改變(×200，HE染色)Note. A: Liver of the vehicle control group(week 4); B: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 4); C: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 6); D: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 9).Figure 1 Histopathological changes in the NAFL rats established by CCl4 at weeks 4, 6, and 9 (HE staining)

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)確認CCl4造模成功

NAFL模型組與溶媒組比較，肝臟表面色澤發(fā)黃，體積、重量增加。組織病理學(xué)觀察，溶媒組未見異常(圖1A)，模型組第4周主要病變?yōu)楦渭毎笈菪灾咀冃?圖1B)，第6、9周可見肝組織以大泡性脂肪變性為主，偶見炎細胞浸潤灶(圖1C，1D)。

2.2 病理學(xué)確認高脂造模成功

大體觀察，與空白對照組比較，模型組肝臟表面發(fā)黃，重量增加。組織病理學(xué)觀察，空白對照組肝臟未見異常(圖2A)，模型組為以大泡性脂肪變?yōu)橹鞯牟∽?見圖2B)。

2.3 2種模型動物肝臟脂質(zhì)含量及肝腦比均有顯著增加

CCl4模型組大鼠在實驗第4，6和9周與各自的溶媒組比較，肝內(nèi)TG、CHO含量及肝腦比明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)；與空白對照組相比，高脂模型組動物肝內(nèi)TG、CHO含量及肝腦比增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

注：A：空白對照組肝臟；B：高脂飼料誘導(dǎo)NAFL模型組肝臟(9周)。圖2 高脂飼料誘導(dǎo)的NAFL模型大鼠的組織病理學(xué)改變(HE染色, ×100)Note. A: Liver of the control group; B: Liver of the NAFL model group established by a high fat diet (week 9).Figure 2 Histopathological changes in the NAFL rats established by a high fat diet (HE staining)

組別Group肝甘油三酯(mg/g) TG 肝膽固醇(mg/g) CHO 肝重 (g) Liver weight腦重(g) Brain weight肝腦比 Liver index溶媒組 Vehicle group 26.5±7.13.6±0.511.7±0.42.1±0.15.6±0.2CCl4模型組(4周)NAFL group established by CCl4(week 4)235.8±45.0***8.0±1.0***16.3±3.9*2.0±0.18.0±1.9*CCl4模型組(6周)NAFL group established by CCl4(week 6)81.8±23.4**5.9±0.9*15.3±1.6**2.0±0.27.8±0.8**CCl4模型組(9周)NAFL group established by CCl4(week 9)205.5±50.4***7.7±2.1**22.9±1.6***2.1±0.111.1±0.9***

注：與溶媒組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note. Compared with vehicle group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

表2 高脂飼料誘導(dǎo)NAFL實驗中各組大鼠肝脂質(zhì)，臟器重量，肝指數(shù)變化Table 2 Changes of liver lipids, organ weight, and liver index in each group of NAFL rat models established by a high fat diet

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 CYP450底物和代謝產(chǎn)物Table 3 CYP450 substrate and metabolites

2.4 色譜行為

本研究采用文獻報道的特異性底物研究主要CYP酶的代謝，底物總結(jié)見表3；各底物的代謝物色譜行為顯示，各底物代謝物色譜峰不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，基線平穩(wěn)，本方法具有一定的專屬性和特異性(圖3)。

注：A：空白S9樣品中1A2代謝物離子通道色譜圖；B：空白S9樣品中2B6代謝物離子通道色譜圖；C：空白S9樣品中2C9代謝物離子通道色譜圖；D：空白S9樣品中2D6代謝物離子通道色譜圖；E：空白S9樣品中3A4代謝物離子通道色譜圖；F：空白S9樣品中內(nèi)標普萘洛爾離子通道色譜圖；G：S9樣品加底物孵育后1A2代謝物離子通道色譜圖；H：S9樣品加底物孵育后2B6代謝物離子通道色譜圖；I：S9樣品加底物孵育后2C9代謝物離子通道色譜圖；J：S9樣品加底物孵育后2D6代謝物離子通道色譜圖；K：S9樣品加底物孵育后3A4代謝物離子通道色譜圖；L：S9樣品加底物孵育后內(nèi)標普萘洛爾離子通道色譜圖。圖3 各CYP酶底物代謝物L(fēng)C/MS/MS色譜圖Note. A: Chromatogram of the 1A2 metabolite ion channel in the control S9 sample; B: Chromatogram of the 2B6 metabolite ion channel in the control S9 sample; C: Chromatogram of the 2C9 metabolite ion channel in the control S9 sample; D: Chromatogram of the 2D6 metabolite channel ion in the control S9 sample; E: Chromatogram of the 3A4 metabolite ion channel in the control S9 sample; F: Chromatogram of the internal standard propranolol ion channel in the control S9 sample; G: Chromatogram of the 1A2 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; H: Chromatogram of the 2B6 metabolite ion channel in the S2 sample plus substrate after incubation; I: Chromatogram of the 2C9 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; J: Chromatogram of the 2D6 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; K: Chromatogram of the 3A4 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; L: Chromatogram of the internal standard propranolol ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation.Figure 3 LC/MS/MS chromatogram of each CYP enzyme substrate metabolites

2.5 CCl4誘導(dǎo)的NAFL模型中，主要CYP酶活性均下降

模型組與溶媒組比較，亞酶CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4酶活性均有不同程度下降，以CYP1A2、2C9、2D6、3A4從第4周起，下降顯著(P<0.001)(圖4A,C-E)，CYP2B6則第6周起下降顯著(見圖4E)。

2.6 高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD模型中，主要CYP酶活性無明顯變化

CYP各亞酶活性在模型組與空白溶媒組比較，CYP1A2， CYP3A4 可見輕度上升，CYP2D6基本沒有改變，CYP2B6和CYP2C9可見下降，但均無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5)。

2.7 CCl4誘導(dǎo)的NAFL模型中，ALT和AST均有顯著升高

主要反映肝臟功能的ALT和AST在CCl4誘導(dǎo)的NAFL模型與各自的溶媒組比較，在3個時間點(4周，6周，9周)均有明顯增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

注：A：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中CYP1A2酶活性變化；B：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中CYP2B6酶活性變化；C：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中CYP2C9酶活性變化；D：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中CYP2D6酶活性變化；E：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中CYP3A4酶活性變化。模型組與同一時間點溶媒組比較對比，***P<0.001。圖4 CCl4誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中CYP酶活性變化Note. A: Changes of CYP1A2 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; B: Changes of CYP2B6 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; C: Changes of CYP2C9 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; D: Changes of CYP2D6 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; E: Changes of CYP3A4 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4. Compared with the vehicle group, ***P< 0.001.Figure 4 Changes of CYP enzyme activity in the NAFL rat models induced by CCl4

圖5 高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中CYP酶活性變化Figure 5 Changes of CYP enzyme activity in the NAFL rat models established by a high fat diet

注：A：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中ALT變化；B：CCl4誘導(dǎo)大鼠NAFL模型中AST變化。模型組與同一時間點溶媒組比較對比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖6 CCl4誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中ALT，AST的變化Note. A: Changes of ALT in the rat NAFL model established by CCl4; B: Changes of AST in the rat NAFL model established by CCl4. Compared with the vehicle group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 6 Changes of ALT and AST in the NAFL rat models established by CCl4

圖7 高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中ALT，AST變化Figure 7 Changes of CYP enzyme activities in NAFL rats established by a high fat diet

2.8 高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD模型中，ALT和AST無明顯變化

ALT和AST在高脂飼料誘導(dǎo)9周的NAFL模型與空白對照組比較，無明顯變化(圖7)。

3 討論

NAFL是由單個或多個因素引起的以甘油三酯為主的脂類物質(zhì)在肝細胞中蓄積，其發(fā)病機制尚未研究透徹，包括NAFL在內(nèi)的NAFLD的治療目前還缺乏有效的方案和藥物。NAFL導(dǎo)致肝臟對肝損傷因素的抗力降低，特別是對肝毒性物質(zhì)、肝臟的缺血、缺氧等耐受性下降。研究不同肝損傷機制誘導(dǎo)的大鼠NAFL模型中CYP酶活性，有助于NAFL發(fā)病機制的探索，為NAFL的治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，具有一定的參考價值。

CYP450超家族中，CYP1A，CYP2C和CYP3A是參與藥物代謝的主要家族[11, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的NAFL模型中主要CYP酶活性(CYP1A2，CYP2B6(第4周除外)，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4)均有較大程度的降低(P<0.001)。且CCl4模型中溶媒對照組的酶活性隨著大鼠周齡增加而明顯下降，但大鼠還不屬于老齡化大鼠，這有待近一步研究[19]。在高脂飼料誘導(dǎo)的NAFL模型中，主要CYP亞酶活性與空白對照組相比較，無明顯差異。同時，反映肝功能的外周血ALT、AST在兩個模型中有顯著差異：CCl4模型組在3個時間點(第4，6，9周)，和溶媒組比較均顯著增加，而在高脂模型組(第9周)中尚無顯著性變化。由此提示，兩種不同方法建立的NAFL模型，雖然均為以大泡性脂肪變?yōu)橹鞯母闻K病變，但是，CCl4通過抑制CYP450亞酶活性，引起肝臟功能受損；而高脂飼料雖引發(fā)了肝細胞的脂肪變性，尚未造成顯著的肝臟功能受損。

截至目前，雖有大量NAFL臨床研究數(shù)據(jù)，以及高脂飼料誘導(dǎo)NAFL的專利和論文，但尚無對CCl4誘導(dǎo)NAFL模型的分析及與高脂模型的比較研究[19-23]。本研究填補了這一空白，結(jié)果顯示在不同機制誘導(dǎo)的NAFL病變，CYP酶活性變化模式有明顯不同，提示CYP酶活性變化可用于鑒別CCl4等化學(xué)性肝損傷誘導(dǎo)的NAFL。