大鼠陰道涂片兩種染色方法比較

張 婷，王 穎，王 莉

(1.河北省人民醫院產科, 石家莊 050000；2. 河北北方學院研究生院, 河北 張家口 075000)

大鼠的動情周期平均4～5 d，是一個動態過程，一般分為四個階段，包括發情前期，發情期，發情后期和發情間期[1-2]。大鼠動情周期可以作為衡量下丘腦-垂體-卵巢生殖軸完整性的有用指標，確定雌鼠動情周期的階段對選擇適宜的交配時機，評估大鼠內分泌狀態都是非常重要的[2-4]。從雌鼠的行為和外觀上不能區分動情周期，陰道脫落細胞可以評估雌鼠動情周期，通常采用陰道涂片染色后觀察細胞形態來確定這個動態過程[5-6]。陰道涂片染色方法有很多種，McLean等[7]認為結晶紫染色簡單易行，可以用于區分小鼠動情周期。快速革蘭氏染色主要成分為結晶紫溶液，但是用時比結晶紫染色少，是人類常用的陰道脫落細胞染色方法，到目前為止還沒有人將其用于大鼠陰道涂片染色，因其操作簡便，快速，適合進行大規模的陰道涂片檢查，本課題組用快速革蘭氏染色法和結晶紫染色法對Sprague Dawley (SD)大鼠陰道脫落細胞進行染色，觀察細胞形態，區分大鼠的動情周期。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10～13 周齡雌性SD大鼠20只，體重216～234 g，平均(225±6)g，清潔級，購自河北醫科大學動物實驗中心[SCXK(冀)2013-1-003]。大鼠在河北醫科大學動物房飼養[SYXK(冀)2013-0026]，屏障環境，室溫：20℃～25℃，相對濕度：45%～60%，每日12 h光照，12 h黑暗，普通鼠糧喂養，飲用自來水。動物實驗過程遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術有限公司，主要成分：1號龍膽紫液(龍膽紫和乙醇)、2號碘溶液(碘和碘化鉀)、3號脫色液(丙酮和乙醇)、4號沙黃溶液(沙黃和乙醇)，0.1%龍膽紫溶液自制(稱取結晶紫粉末0.1 g，溶于100 mL的雙蒸水中，攪拌均勻即可)。主要儀器為正置顯微鏡(ECLIPSE E100，Nikon，Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作大鼠陰道涂片

用無菌棉花和牙簽的鈍頭制作棉簽，并用無菌生理鹽水將其浸濕，取出干凈的載玻片用5 mL注射器滴2～3滴生理鹽水備用。每天上午8:00～9:00將20只SD雌鼠從鼠籠中取出，并將其放在籠蓋上，一只手捉住大鼠的尾巴并輕輕提起，大鼠會用前爪抓住籠蓋，暴露陰道口，用生理鹽水濕潤的無菌棉簽擦拭陰道口后，將事先準備好的棉簽插入大鼠陰道內0.5～1 cm，輕柔旋轉1～2圈，將棉簽均勻涂在事先準備好的干凈的載玻片上的鹽水中進行涂片，每次兩張，分別做結晶紫染色和快速革蘭氏染色，連續6 d。

1.3.2 陰道涂片染色方法

(1)快速革蘭氏染色：①涂片自然風干后，用移液器將50 μL 1號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將1號溶液緩慢沖洗干凈；②將50 μL 2號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將2號溶液緩慢沖洗干凈；③將50 μL 3號脫色液滴在載玻片上進行脫色，靜置10 s，用蒸餾水將3號溶液緩慢沖洗干凈；④將50 μL 4號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將4號溶液緩慢沖洗干凈，自然風干。

(2)結晶紫染色：①涂有大鼠陰道脫落細胞的載玻片風干后用無水乙醇固定10 min；②將50 μL 0.1%龍膽紫溶液滴在載玻片上，靜置1 min；③將載玻片放入蒸餾水中水洗1 min，再用干凈的蒸餾水沖洗5 s，自然風干。

1.3.3 大鼠動情周期判定標準

在10倍鏡下觀察每個涂片中的細胞形態，依據細胞類型區分SD大鼠動情周期。首先評估白細胞的存在，發情間期和發情后期的一個顯著特征是白細胞大量存在，如果白細胞難以觀察到，則該階段是發情前期或發情期[1]。 發情前期平均持續14 h，這個階段存在有核上皮細胞和無核角化細胞，其中圓形有核上皮細胞占主要地位[8]；發情期持續24～48 h，滿視野可見無核角化上皮細胞；發情后期只有6～8 h，主要為無核角化上皮細胞和白細胞；發情間期持續時間為48～72 h，這個階段的特點是大量白細胞、少量無核角化上皮細胞(也可能沒有)、大小不一有核上皮細胞[3,8]。

2 結果

2.1 結晶紫染色

SD大鼠性周期不同階段陰道涂片結晶紫染色結果如下：(1)發情前期：涂片中主要為圓形或橢圓形有核細胞，細胞核被染成深紫色，細胞質呈淺紫色，細胞膜有時欠完整，也可見無核角化上皮細胞，呈淺紫色(圖1A)；(2)發情期：涂片中滿視野呈現淺紫色的不規則多邊形無核角化細胞(圖1B)；(3)發情后期：可見大量白細胞和少量無核角化細胞，白細胞小而圓，呈深紫色，白細胞形態有時有輕微變形(圖1C)；(4)發情間期：涂片中主要是白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在，無核角化細胞和有核細胞細胞質呈淺紫色，白細胞和有核細胞細胞核呈深紫色(圖1D)。

2.2 快速革蘭氏染色

SD大鼠性周期不同階段陰道涂片快速革蘭氏染色結果如下：(1)發情前期：有核細胞為圓形或橢圓形，細胞核被染成紫紅色，細胞核輪廓清晰，細胞質被染成玫紅色，細胞膜完整，整體層次感明顯，易于區分，同時存在玫紅色的無核角化細胞(圖2A)；(2)發情期：涂片中滿視野為玫紅色的無核角化細胞，形態呈不規則的多邊形(圖2B)；(3)發情后期：大量白細胞和少量無核角化細胞，白細胞為小的圓形細胞，呈深紅色，細胞形態清晰(圖2C)；(4)發情間期：白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在(圖2D)。

SD大鼠陰道涂片通過結晶紫染色和快速革蘭氏染色都能顯示出細胞形態，區分細胞類型，很好的識別大鼠動情周期的階段。結晶紫染色法用時約12 min，快速革蘭氏染色法用時小于1 min。

注： A：發情前期；B：發情期；C：發情后期；D：發情間期。圖A黑色箭頭和圖D紅色剪頭所指是有核細胞，細胞核染成深紫色，細胞質染成淺紫色。圖B黑色箭頭和圖D藍色箭頭所指是無核角化細胞。圖C和圖D黑色箭頭所指是白細胞。圖1 陰道涂片結晶紫染色結果(×10)Note.Vaginal smears with crystal violet staining at various phases of the estrous cycle (A-D). Proestrus (A), estrus (B), metestrus (C), and diestrus (D). Black arrowhead in A and red arrowhead in D indicate nucleated epithelial cells. The nucleus was stained deep purple, and the cytoplasm was stained lilac. Black arrowhead in B and blue arrowheads in C and D indicate cornified squamous epithelial cells. Black arrowhead in D indicates leukocytes.Figure 1 The results of crystal violet staining of the rat vaginal smears

注：A：發情前期；B：發情期；C：發情后期；D：發情間期。圖A黑色箭頭和圖D紅色剪頭所指是有核細胞，細胞核染成紫紅色，細胞質染成粉紅色。圖B黑色箭頭和圖C藍色箭頭所指是無核角化細胞。圖C和圖D黑色箭頭所指是白細胞。圖2 快速革蘭氏染色結果(×10)Note. Vaginal smears with rapid Gram staining at various phases of the estrous cycle (A-D). Proestrus (A), estrus (B), metestrus (C), and diestrus (D). Black arrowhead in A and red arrowhead in D indicate nucleated epithelial cells. The nucleus was stained amaranth, and the cytoplasm was stained rose red. Black arrowhead in B and blue arrowhead in D indicate cornified squamous epithelial cells. Black arrowhead and blue arrowhead in C indicate a leukocyte and cornified squamous epithelial cell, respectivelyFigure 2 The results of rapid Gram staining of the rat vaginal smears

3 討論

大鼠的動情周期主要通過對大鼠陰道涂片染色后區分細胞類型來識別[9]。蘇木素-伊紅(HE)染色是基本的組織染色方法，也用于細胞染色，染色結果背景清楚，細胞形態清晰，細胞核藍染，細胞質呈粉紅色，但是對染色技術要求較高，染色時間或是鹽酸酒精脫色時間控制不好，染色失敗率高[10]。巴氏染色也用于陰道細胞學染色，尤其是在人類中作為篩查宮頸癌的方法(即巴氏涂片)，這種染色方法提供更好的細胞核染色細節并使細胞質呈現橙色、粉紅色或藍色，便于區分細胞角化的程度，但是這種染色需要多色染料，方法復雜[3]。大鼠動情周期的確定不需要這些細節水平，因此HE染色或是巴氏染色不適于用于大鼠陰道涂片染色。大鼠陰道涂片染色常用改良吉姆薩染色、甲苯胺藍染色、瑞士染色、美蘭染色，染色原理都是堿性染料使細胞核著色[3,5,10]，結晶紫染色、快速革蘭氏染色也是利用此特點對大鼠陰道細胞進行染色。

本課題組通過對大鼠陰道涂片進行結晶紫染色和快速革蘭氏染色后可以檢測到3種細胞：有核上皮細胞，呈圓形或橢圓形，細胞質染色較輕，細胞核染色深；角化細胞染色均勻，呈多邊形，沒有細胞核；白細胞染色深，呈圓形，形態小，10倍鏡下不能觀察到細胞核。本課題組通過染色后觀察細胞形態識別大鼠動情周期各個階段，發情前期：主要為有核細胞，也存在無核角化細胞；發情期：可見成片的無核角化細胞；發情后期：大量白細胞和少量無核角化細胞；發情間期：白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在。與王潔等[11]人通過分析陰道涂片中3種細胞總量區分大鼠動情周期的四個階段結果基本一致，但是本課題組通過染色發現發情前期和發情期不存在白細胞，這與文獻報道的一致[3,7]。陰道涂片染色法與陰道涂片不染色進行細胞計數相比，染色后細胞形態更為清晰，易于區分，而且染色法區分大鼠動情周期簡單、直觀、節省時間，通過細胞計數后再進行統計分析較為復雜。

本實驗通過對快速革蘭氏染色和結晶紫染色兩種方法的比較，發現這兩種染色方法都能清晰的顯示出有核上皮細胞、無核角化細胞和白細胞的形態，可以很好的識別SD大鼠動情周期的四個階段，而且這兩種方法操作簡單，易于掌握。快速革蘭氏染色法陰道細胞容易著色，形態清晰，色彩鮮明，層次感強烈，并且省略了無水乙醇固定的步驟，可以直接進行染色，操作簡單，用時不超過1 min，與結晶紫染色相比(最少12 min)節省了染色時間。與改良吉姆薩染色、甲苯胺藍染色、瑞士染色、美蘭染色、結晶紫染色相比，快速革蘭氏染色法同樣可以很好的識別雌鼠的動情周期，但是用時最短。本實驗為大鼠陰道涂片染色增加了一種簡便、易行的方法，實驗室中需要大規模的篩查大鼠動情周期時，應用快速革蘭氏染色法，可以很大程度上節省時間和精力。