miR-27a對胃癌細胞凋亡影響的體外研究

張悅，管敘文，王婧雅，黃鼎智

（天津醫科大學腫瘤醫院消化腫瘤內科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060）

胃癌是消化系統常見惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤第二位[1]。雖然胃癌治療方式有一定進展，但預后并沒有得到相應的改善。近年來，腫瘤治療進入了靶向治療新時代，隨著對胃癌發生、發展分子機制的深入探索，靶向藥物在胃癌中的應用逐漸增多[2]，但尚未有突破性的結果，因此尋找新的治療靶點具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一種小分子非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA分子 3′非翻譯區（3′untranslated region，3′UTR）結合而影響腫瘤細胞的生物學行為。miR-27a位于人19號染色體上，屬于miRNA-23a-24-27a簇，已證實在腎細胞癌、肝細胞癌、神經膠質瘤及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達上調，參與調控細胞增殖、凋亡、分化等病理生理過程[3-6]。有文獻報道miR-27a在胃腺癌中高表達，并通過與抑制素基因靶向結合而抑制胃癌細胞生長[7]。筆者前期的研究表明miR-27a在胃癌中表達顯著上調，進一步的預后分析顯示miR-27a高表達者預后欠佳[8-9]。以上研究結果提示miR-27a在胃癌中可能發揮了癌基因的作用。叉頭框蛋白O1（forkhead box transcription factors O 1，FOXO1）是FOXO家族中研究較為成熟的一員，在腫瘤或其他疾病中發揮了重要的作用。研究表明，FOXO1在一些腫瘤中可作為miRNA的靶基因，如在乳腺癌中，miR-27a、miR-182及miR-96可以協同靶向抑制FOXO1表達，進而促進了細胞增殖并參與了細胞周期轉換[10]。在肺癌中，miR-411通過沉默FOXO1表達促進肺癌細胞增殖[11]。基于上述研究背景，本實驗旨在探討miR-27a對胃癌細胞株SGC-7901的凋亡作用，同時研究敲低FOXO1對胃癌細胞凋亡的影響，并對miR-27a與FOXO1的關系進行驗證與分析，以期為胃癌治療新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株SGC-7901購自北京協和醫科大學細胞資源中心；Trizol Reagent，lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司；SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit購自大連寶生物公司；miR-27a mimics質粒、miR-27a mimics對照質粒、miR-27a inhibitors質粒、miR-27a inhibitors對照質粒、si-FOXO1質粒及si-FOXO1對照質粒均購自上海吉瑪公司；FOXO1一抗購自美國Abcam公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；報告基因質粒購自美國Progada公司；細胞凋亡Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 SGC-7901細胞培養于含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中。取生長狀態良好的細胞，于轉染前一天將細胞接種于培養皿中，按照說明書用lipofectamine 2000轉染試劑盒分別轉染miR-27a mimics質粒，miR-27a mimics對照質粒，miR-27a inhibitors質粒，miR-27a inhibitors對照質粒，si-FOXO1質粒及si-FOXO1對照質粒，細胞培養24～48 h后進行后續的實驗。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率-Annexin V/PI雙染色法 收集胃癌細胞SGC-7901到10 mL的離心管中，每樣本細胞數為3×106/mL，1 000 r/min離心5 min后棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min。用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞,孵育緩沖液洗1次。加入Annexin V-FITC/PI溶液，4℃下孵育20 min。最后補400 μL PBS，隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。加入Annexin V-FITC/PI溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動。隨即進行流式細胞儀分析，流式細胞儀激發光波長488 nm，用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，用波長大于560 nm的濾器檢測PI。凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則無此特性。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。

1.2.3 Western blot檢測 p53、BCL-2、LC3I、LC3II及FOXO1蛋白表達 收集轉染后48 h的SGC-7901細胞，加入RIPA細胞裂解液后離心收集SGC-7901細胞中總蛋白，經10%-15%SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，4℃、5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBS-T洗去一抗，辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，TBS-T洗滌3次，ECL試劑盒顯影，以β-actin作為內參。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因試驗 根據生物信息學預測結果得到miR-27a的潛在靶基因FOXO1，同時得到miR-27a在FOXO1基因3′UTR中結合位點，將含有靶位點的3′UTR序列及突變型3′UTR序列進行全基因合成，然后將目的序列構建至熒光素酶報告基因載體,將miR-27a表達質粒單獨轉染或者與熒光素報告載體共轉染至SGC-7901細胞。轉染后48 h以酶標儀檢測熒光素酶的活性。

1.2.5 RNA的提取及Real-time PCR檢測 采用Trizol試劑提取SGC-7901細胞總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量。根據SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit試劑盒說明書加入500 ng的總RNA及逆轉錄反應所需試劑。得到的逆轉錄產物用相應的PCR引物在定量PCR儀進行實時定量PCR。PCR條件為95℃5 s，60℃34 s，進行40個循環。miR-27a PCR引物序列上游：5′-CGGCGGTT TCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-CCAGTGCAGG GTCC GAGGTAT-3′；FOXO1 基因引物序列上游 5′-TGGACATGCTCAGCAGACATC-3′，下游：5′-TTGG GTCAGGCGGTTCA-3′；β-actin基因引物序列上游：5′-ACACCTTCTACAATGA GCTG-3′，下游：5′-CAT GATGGAGTTGAAGGTAG-3′。

1.3 統計學分析 所有數據都至少來自3組獨立的實驗。數據處理采用SPSS軟件，計量資料用x±s表示，所有統計結果以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 上調miR-27a及敲低FOXO1對胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡的影響 Annexin V/PI雙染色法可以區分不同凋亡時期的細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左上象限表示機械損傷細胞（Annexin-FITC-/PI+）；左下象限顯示正常活細胞（Annexin-FITC-/PI-）；右上象限是凋亡中晚期細胞（Annexin-FITC+/PI+）；右下象限為早期凋亡細胞（Annexin-FITC+/PI-)。凋亡率為右上象限與右下象限細胞占總細胞數的比例。實驗結果如圖1A，miR-27a過表達組及其對照組細胞凋亡率分別為16%、29%，表明miR-27a過表達可顯著抑制SGC-7901細胞凋亡（P＜0.05）。而如圖1B所示，FOXO1低表達組及其對照組細胞凋亡率分別為5%、10%，表明FOXO1低表達亦顯著抑制SGC-7901細胞凋亡（P＜0.05）。

圖1 上調miR-27a或敲低FOXO1抑制胃癌細胞凋亡Fig 1 Over-expression of miR-27a or low-expression of FOXO1 inhibited gastric cancer cell apoptosis

2.2 上調 miR-27a及敲低FOXO1對胃癌細胞SGC-7901 p53、BCL-2、LC3I及 LC3II的表達水平的影響 Westernblot檢測結果顯示，敲低FOXO1組，FOXO1蛋白表達較對照組下調（P＜0.05）；相對各自的對照組，上調miR-27a組及si-FOXO1組凋亡相關蛋白p53表達水平下降，BCL-2表達上調，自噬相關蛋白 LC3I、LC3II表達下降（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 上調 miR-27a及敲低 FOXO1后 p53、BCL-2、LC3I、LC3II蛋白表達變化Fig2 Changes in expression of p53,BCL-2,LC3I and LC3II in miR-27a over-expression and FOXO1 low-expression

2.3 miR-27a靶基因的驗證 通過生物信息學方法，用靶基因預測數據庫TargetScan、miRDB及miRanda網站預測miRNA-27a的靶基因,獲得潛在的靶點FOXO1。Realtime-PCR檢測結果顯示miR-27a高表達質粒、miR-27a低表達質粒轉染至胃癌細胞后miR-27a水平分別上調、下調，表明了miR-27a高表達質粒、miR-27a低表達質粒成功轉染至胃癌細胞中。應用雙熒光素酶報告基因驗證，結果顯示，在野生型FOXO1 3′UTR組，miR-27a高表達組的熒光素酶活性比相應的對照組低，miR-27a低表達組的熒光素酶活性則比相應的對照組高（P＜0.05）。而在突變型FOXO1 3′UTR組，miR-27a高表達或低表達后熒光素酶活性與對照組相比并沒有明顯變化（P＜0.05）（圖 3）。

圖3 驗證miR-27a與FOXO1之間的靶點關系Fig 3 Verification of target relationship between miR-27aand FOXO1

2.4 miR-27a對胃癌細胞SGC-7901中FOXO1表達的影響 Realtime PCR結果顯示，相對于各自對照組，上調或下調miR-27a后，SGC-7901細胞中FOXO1 mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。轉染miR-27a mimic組細胞中FOXO1蛋白水平較其對照組低（P＜0.05），轉染miR-27a inhibitor組細胞中FOXO1蛋白水平較其相應對照組高（P＜0.05）（圖 4）。

圖4 miR-27a在蛋白水平上負性調控FOXO1的表達Fig 4 miR-27a negatively regulated the protein expression of FOXO1

3 討論

近年來，miRNA在人類腫瘤研究領域獲得較多關注。miRNA是一種非編碼短鏈RNA，通過與靶基因mRNA 3′UTR完全或不完全堿基互補配對，促進靶基因mRNA的降解或抑制靶基因的翻譯，發揮了癌基因或抑癌基因的功能。目前miR-27a在胃癌中的體內外研究多集中于其對腫瘤細胞增殖、侵襲遷移能力及細胞周期阻滯的影響，而針對細胞凋亡的研究尚屬空白。因而本研究對miR-27a在胃癌細胞凋亡中的作用及作用機制進行了初步探索。

細胞凋亡是由基因控制的程序化細胞主動死亡，在調節機體正常發育和維持穩態中發揮重要作用。腫瘤細胞存在凋亡逃逸，從而獲得了無限增殖的能力。本研究對轉染miR-27a過表達質粒的中分化人胃腺癌SGC-7901細胞株的凋亡情況進行了研究，結果顯示，在胃癌細胞中miR-27a過表達可以顯著抑制細胞凋亡，提示miR-27a在胃癌的發生發展中發揮了癌基因的作用并可作為潛在的胃癌治療新靶點。

FOXO是FOX家族中的O亞族，是生理及病理狀態下均發揮重要作用的轉錄因子，由FOXO1、FOXO3、FOXO4及FOXO6組成，4個成員各自發揮著不同的功能[12]。研究表明FOXO1在乳腺癌、肺癌、原發性肝癌、骨肉瘤等腫瘤中呈低表達，可通過調控下游的腫瘤相關基因的表達而參與細胞增殖、凋亡及轉移等過程，發揮著抑癌基因的功能[10，13-14]。Reagan-Shaw等發現抑制乳腺癌細胞中PI3K表達后，FOXO1表達上調，進而促進了細胞凋亡和導致細胞周期阻滯[15]。本研究中敲低SGC-7901細胞中FOXO1表達后得到了與轉染miR-27a mimics類似的實驗結果，即FOXO1表達下調抑制胃癌細胞凋亡。提示FOXO1可以為胃癌治療提供新的方向。

通過生物信息學方法得到miR-27a潛在的靶點FOXO1，目前研究亦提示在一些腫瘤中miR-27a與FOXO1存在靶點關系[10，15]。本研究應用雙熒光素酶報告基因進行了驗證，結果表明pre-miR-27a前體能夠顯著降低野生型FOXO1 3′UTR組質粒的熒光活性，而對突變型FOXO1 3′UTR組質粒沒有影響，最終證實了FOXO1是胃癌SGC-7901細胞中miR-27a的靶基因。進一步研究顯示上調/下調miR-27a后，SGC-7901細胞中FOXO1mRNA水平無明顯變化，FOXO1蛋白水平相應下調/上調，這提示miR-27a能夠在蛋白翻譯水平負性調控FOXO1蛋白的表達。由此推斷：mi-R27a通過抑制靶基因FOXO1的表達抑制胃癌細胞凋亡。

BCL-2是細胞凋亡相關研究中研究最多的一種抗凋亡蛋白。而p53蛋白是重要的細胞凋亡調控因子，可以監視DNA損傷及誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。據文獻報道BCL-2能夠抑制p53介導的凋亡[16]。本研究應用Western blot法對上調miR-27a/敲低FOXO1的胃癌細胞中BCL-2及p53水平進行檢測，結果顯示BCL-2表達上調，p53表達下降，由此進一步印證了miR-27a抑制胃癌細胞凋亡及FOXO1促進細胞凋亡的結論。同時可以推斷，BCL-2通過抑制p53的表達參與了miR-27a/FOXO1軸對胃癌細胞凋亡的影響過程，進而促進胃癌的發生發展，但其中的作用機制尚需深入研究。

腫瘤細胞受細胞程序性死亡的調控，而凋亡和自噬是程序性死亡的兩種形式，且凋亡和自噬有著密切的關系。有文獻報道，葡萄籽原花青素可以通過調控ROS表達而誘導凋亡和自噬，當加入3-MA抑制自噬時,葡萄籽原花青素誘導細胞凋亡的能力下降，表明了自噬可以促進凋亡[17]。本研究對上調miR-27a/敲低FOXO1的胃癌細胞中自噬相關蛋白LC3I、LC3II進行檢測，結果表明 LC3I、LC3II表達下降，由此我們可初步推斷miR-27a過表達及si-FOXO1可以抑制自噬而抑制胃癌細胞凋亡，從而在胃癌的進展過程中發揮重要作用。

由于胃癌早期篩查及診斷率低，多數胃癌患者在被確診時已為晚期，化療為主要治療手段，但因原發或獲得性耐藥的出現，胃癌治療陷入瓶頸。由于胃癌具體的發病機制未被闡明，故尚無良好的靶點。本研究分析了miR-27a對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響及其作用機制，初步得出了mi-R27a可通過靶向抑制FOXO1的表達抑制胃癌細胞凋亡的結論，這提示mi-27a/FOXO1軸可以作為胃癌治療的新靶點。