水酶法提取葵花籽油工藝及機理

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(1.江南大學食品科學與工程國家重點實驗室,江蘇無錫 214122; 2.江蘇俊啟生物科技股份有限公司,江蘇南通 226600; 3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

葵花籽是一種重要的油料作物,也是世界上種植面積最廣的油料作物之一[1],葵花籽仁中含47%～65%的油脂,其不飽和脂肪酸占脂肪酸的70%以上[2]。高含量的亞油酸和油酸使葵花籽油具有超過其他植物油溶解膽固醇的能力,有利于降低心血管疾病和高血脂癥狀的發生[3]。

對于油料作物,傳統的提油方法主要有壓榨法和溶劑萃取法。壓榨法的優點是簡單易操作,但提油率普遍不高,而且高溫壓榨會對油的質量品質有一定影響,如造成油脂易氧化[4],易產生縮水甘油酯等有毒有害物質[5]。溶劑萃取法的優點是提油效率高,過氧化值低,但存在溶劑殘留問題,導致食用安全性較差。操作危險,環境污染大[6]。且都會造成蛋白嚴重變性,只能作為農作物肥料或者動物飼料使用。因此,高效開發利用葵花籽需要一種能夠替代傳統油脂加工的新型加工方法。水酶法作為一種新興的植物油脂提取技術,是一種能夠同時分離油和蛋白質的生態友好方法[7]。它利用酶輔助水相對油料進行提取,利用油與水互不相溶的特性,在適當的條件下對油脂和非脂組分進行分離。水酶法的優點主要是反應條件溫和,生產設備成本較低,對環境影響較小。上個世紀中期,有研究者發現用酶處理某些油料作物時,可以明顯提高出油率，影響油脂得率的因素主要有油料的粉碎程度、含水量、酶的品種、酶的添加量和酶解的時間等。Chi等[8]研究通過酶輔助水相提取花生油，對得到的頑固乳狀液進行二次破乳提油，大大降低了酶用量。李鵬飛等[9]研究通過粉碎方式的改變，實現物料粉碎的更徹底，從而使水酶法提取油脂的得率得到進一步提高。

迄今為止,水酶法已經應用于花生、葵花籽、玉米胚芽、油茶籽、亞麻籽、紅花籽、西瓜籽、大豆、芝麻等多種油料作物。但不同油料水酶法加工時也存在不同難題,如原料的粉碎、酶種的選擇、油相的分離以及乳狀液的破除等,只有充分認識到不同原料和處理因素的影響,才能較好地實現油脂提取率的提升。本文通過對葵花籽物料的粉碎，酶種選擇、用量及其他單因素條件的研究得出最佳提取條件。并將水酶法提取的葵花籽油與市面其他常見冷榨葵花籽油進行對比，初步得出水酶法提取的葵花籽油品質優劣，為水酶法提油的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花籽仁 產自內蒙古通遼;A966纖維素酶(酶活8200 CCU/g) 諾維信生物技術有限公司;PEP果膠酶(酶活5000 PEU/g) DSM中國有限公司;AFP酸性蛋白酶(酶活1×105U/g) DSM中國有限公司;NY-10中性蛋白酶(酶活5×104U/g) 日本天野酶制劑品株式會社;Protex 6L堿性蛋白酶(酶活3×105IU) 杰能科生物工程有限公司;尼羅紅、異硫氰酸熒光素酯(FITC)熒光染色劑 購于Sigma公司;成品葵花籽油A、B、C 市售低溫壓榨葵花籽油。

中草藥粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;精粉機 實驗室自制;高精度超級恒溫水浴 上海驚宏實驗設備有限公司;RW20型強力攪拌器 上海標本模型廠;臺式離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司;LXJ-Ⅱ型離心機 上海醫用分析儀器廠;S3500型激光粒度分析儀 美國Microtrac公司;101-1-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠;DELTA320型pH計 上海梅特勒公司;CM1950型冰凍切片機 德國徠卡公司;LSM710型激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司;GC-2010AF型氣相色譜 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取葵花籽油工藝 水酶法提取葵花籽油的工藝大致流程為先對葵花籽仁進行預處理,預處理條件為按照1∶5的料液比在0.001 mol/L鹽酸溶液,90 ℃條件下反應1 h,60 ℃條件烘干5 h預處理后的葵花籽至水分低于10%,粉碎干燥后的葵花籽,先經中藥粉碎機初粉30 s(10 s/次),將初粉后的物料進行一定程度的精粉。精粉后的葵花籽仁按一定的料液比加入去離子水,攪拌均勻,將水浴鍋溫度調至所用酶的最適溫度、pH,見表1。加入一定量不同的酶酶解解一段時間,對酶解液在室溫條件下進行5000 r/min離心10 min,分別得到游離油Ⅰ、乳狀液Ⅰ、水相和渣相。收集最上層的游離油層后,小心取出乳狀液層及乳狀液層表面取不出的油,進行二次離心,收集游離油Ⅱ,合并游離油Ⅰ和游離油Ⅱ即為游離油。

圖1 水酶法提取葵花籽油工藝路線Fig.1 Route of aqueous enzymatic method of sunflower seed oil

條件酸性蛋白酶中性蛋白酶堿性蛋白酶纖維素酶果膠酶溫度(℃)4550504045pH3.57.08.56.05.0

1.2.2 葵花籽仁顆粒粒徑的測定 為了得到適合水酶法工藝的顆粒大小,對顆粒粉碎條件進行了探索。先采用中藥粉碎機(刀片式)對葵花籽仁進行初粉,初粉條件為30 s(10 s/次)。再將經過初粉后的葵花籽通過精粉機,精粉次數為一、二、三、四次,將經過初粉而未經過精粉的葵花籽作為對照組。取不同粉碎處理的葵花籽物料約0.5 g置于50 mL離心管中,加入30 mL丙酮,20 ℃條件下,漩渦混合振蕩1 min,使物料均勻分散于液體中。滴加經過簡單處理后的10%葵花籽物料液體至激光粒徑儀樣品池中測定,其為體積平均粒徑[10]。

1.2.3 影響水酶法提取葵花籽油的單因素試驗

1.2.3.1 粉碎處理 取不同粉碎程度即未精粉(對照)和精粉一、二、三、四次的葵花籽物料50 g,按照料水比1∶5 (w/v)加入去離子水,待水浴鍋溫度上升至60 ℃,調節體系pH至8.5,按照質量比加入2%(v/w)堿性蛋白酶,反應1.5 h,5000 r/min室溫離心10 min得到油相Ⅰ、乳狀液相、水相、渣相,對乳狀液室溫條件下進行8000 r/min 15 min的二次離心,得到油相Ⅱ,游離油即為油相Ⅰ與油相Ⅱ,按照公式(1)計算葵花籽各相的含油量。

1.2.3.2 酶種類 取精粉兩次的葵花籽物料50 g,按照料水比1∶5 (w/v)加入去離子水,待水浴鍋溫度上升至所用酶最適溫度(見表1),調節體系pH至所用酶最適pH,按照質量比加入2%(v/w)的果膠酶、不同蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)、纖維素酶,反應1.5 h,5000 r/min室溫離心10 min得到油相Ⅰ、乳狀液相、水相、渣相,對乳狀液在室溫條件下進行8000 r/min 15 min的二次離心,得到油相Ⅱ,游離油即為油相Ⅰ與油相Ⅱ,按照公式(1)計算葵花籽各相的含油量。

1.2.3.3 料水比 取精粉兩次的葵花籽物料50 g,按照料水比1∶4,1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 (w/v)加入去離子水,待水浴鍋溫度上升至60 ℃,調節體系pH至8.5,按照質量比加入2%堿性蛋白酶,反應1.5 h,5000 r/min室溫離心10 min得到油相Ⅰ、乳狀液相、水相、渣相,對乳狀液室溫條件下進行8000 r/min 15 min的二次離心,得到油相Ⅱ,游離油即為油相Ⅰ與油相Ⅱ,按照公式(1)計算葵花籽各相的含油量。

1.2.3.4 反應時間 取精粉兩次的葵花籽物料50 g,按照料水比1∶5 (w/v)加入去離子水,待水浴鍋溫度上升至60 ℃,調節體系pH至8.5,按照質量比加入2%堿性蛋白酶,反應0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h,5000 r/min室溫離心10 min得到油相Ⅰ、乳狀液相、水相、渣相,對乳狀液室溫條件下進行8000 r/min 15 min的二次離心,得到油相Ⅱ,游離油即為油相Ⅰ與油相Ⅱ,按照公式(1)計算葵花籽各相的含油量。

1.2.3.5 酶添加量 取精粉兩次的葵花籽物料50 g,按照料水比1∶5 (w/v)加入去離子水,待水浴鍋溫度上升至60 ℃,調節體系pH至8.5,按照質量比加入0.08%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(v/w)的堿性蛋白酶,反應1.5 h,5000 r/min室溫離心10 min得到油相Ⅰ、乳狀液相、水相、渣相,對乳狀液室溫條件下進行8000 r/min 15 min的二次離心,得到油相Ⅱ,游離油即為油相Ⅰ與油相Ⅱ,按照公式(1)計算葵花籽各相的含油量。

1.2.4 水酶法提取葵花籽油工藝的評價指標 測量并記錄乳狀液相Ⅱ和水相體積,Rose-Gottlieb[11]測定油脂含量。索氏抽提法測渣相油脂含量。

式(1)

式中:Y-含油量;i-游離油相、乳狀液相、水相或渣相;Oi-i相葵花籽油的質量,g;∑Oi-各相中葵花籽油的總質量,g。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡分析 對于不同粉碎處理的葵花籽仁樣品,放入-80 ℃冰箱冷凍,待凝固后取出制取2 mm×2 mm方塊的樣品,用一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物的包埋液對其直接進行包埋,將包埋后的樣品置于冰凍切片機中進行凍結,然后用冰凍切片機將其切成約為20 μm的薄片,分別滴加10 μL 0.1%尼羅紅染液和10 μL 0.1% FITC染料對油脂和蛋白質進行染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察其微觀結構[12]。對于渣相,方法步驟同粉碎樣品。

對于乳狀液相,取1 mL乳狀液放入5 mL離心管中,分別滴加10 μL 0.1%尼羅紅染料和10 μL 0.1% FITC染料,搖勻后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察分析[13]。對于水相,方法步驟同乳狀液。

1.2.6 葵花籽油的主要理化性質分析 對水酶法制取的油脂進行真空脫水(60 ℃,0.07 MPa,1 h)后,與三種常見市售低溫壓榨葵花籽油一起進行了對比分析。采用GBT5527-2010測折光指數,GBT5526-85測相對密度,GBT5532-2008測碘值,GBT5534-2008測皂化值,采用羅維朋比色儀(133.4 mm比色槽)測色澤,GBT5530-2005測酸值,GBT5538-2005測過氧化值。

1.2.7 葵花籽油中反式脂肪酸分析 采用氣相色譜法測定,步驟如下。

脂肪酸甲酯化:取樣品油0.15 g于20 mL具塞試管中,加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液于65 ℃恒溫皂化30 min,加入2 mL三氟化硼乙醚甲醇溶液(體積比1∶3)繼續加熱30 min(充分搖晃),冷卻至室溫,加入2 mL正己烷搖晃,靜置分層,加入飽和NaCl溶液分層,取上層有機相1.5 mL,加入無水Na2SO4,10000×g離心過膜,進行GC分析[14]。

GC條件分別為色譜柱:CP-Sil 88(100 m×0.25 mm×0.20 μm);載氣:高純He;柱流量:1.2 mL/min;柱溫:初溫145 ℃保溫10 min,以2 ℃/min的速率升溫至185 ℃并保溫15 min,以2 ℃/min的速率升溫至215 ℃保溫15 min;進樣口溫度250 ℃;分流比15∶1;進樣量:0.5 μL[15]。

1.3 數據處理

所有數據均為3個平行測定結果,全部實驗數據均表示為均值±標準偏差,用軟件Excel 2013和Origin 9.0進行數據處理和作圖,采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析和Duncan多重比較法進行數據分析,其中不同字母(如a、b、c)表示差異顯著(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 粉碎方法對水酶法提葵花籽油的影響

就粉碎方式而言,圖2a與圖2b所示,與對照組的刀片式初粉碎相比,經精粉機后葵花籽醬的平均粒徑顯著下降(p<0.05),過精粉機的次數越多,平均粒徑越小,精粉四次后平均粒徑可達19.68 μm,且顆粒大小分布更均勻,但精粉二次以后各粉碎次數之間無顯著差異。

就游離油含油量而言,圖2c所示,精粉二次的游離油含油量最高,且渣相含油量也較低。主要原因是在此條件下葵花籽原料既得到充分粉碎,又沒有使蛋白質體在油脂周圍過分分散,加溶液浸提時,葵花籽細胞內游離油被最大化釋放,形成的乳狀液相對不穩定。在粉碎起始階段,隨著粉碎程度的增加,渣相中的含油量不斷的降低,說明渣相中大顆粒原料含量在不斷下降,通過在水相作用和酶解作用條件下,大顆粒中的油脂越來越多的被游離釋放出來[16]。精粉三次、四次后平均粒徑下降不明顯,游離油含油量有所下降,乳狀液含量較多,粉碎程度進一步增加,會進一步加劇乳化程度。

圖2 加工方式對葵仁粒徑及提油率的影響Fig.2 Effects of processing methods on the diameter and oil extraction rate of sunflower seeds注:a,b,c,d字母表示不同粉碎次數之間對各個統一指標的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 水酶法提取葵花籽油的單因素實驗

2.2.1 酶種類對水酶法提取葵花籽油的影響 葵花籽原料的細胞壁主要是由纖維素及多糖類物質組成,蛋白質主要存在于細胞內。可以通過酶制劑作用細胞的主要成分,從而降解細胞中的主要成分,釋放出油脂,提高游離油的得率。

在相同反應條件分別比較了酸性蛋白酶、中性蛋白酶[17]、堿性蛋白酶[18]、纖維素酶和果膠酶[19]對游離油含油量的影響。由圖3知采用Protex 6L堿性蛋白酶游離油含油量較高。果膠酶效果不好是因為葵花籽細胞中果膠含量并不豐富,并不是束縛油脂釋放的最重要原因。而纖維素酶效果不好是因為葵花籽經過精粉碎后,細胞中的大分子纖維素結構被破壞,纖維結構已不再成為影響油脂釋放的最重要因素。就蛋白酶而言,葵花籽蛋白的等電點pI為4.5,酸性偏中性,當體系pH=4.5時,葵花籽蛋白溶解度較差,在反應的過程中,析出的蛋白質裹挾著油脂沉入底部;pH>4.5時,葵花籽蛋白溶解度會隨著pH增大而增大,溶解度越大,析出的蛋白質就越少,在酶的作用條件下,油脂釋放的也越完全[20]。故堿性蛋白酶的作用效果最佳。

圖3 酶種類對水酶法提取葵花籽油的影響Fig.3 Effects of different enzymes to the aqueous enzymatic extraction of sunflower seed oil注:a,b,c,d字母表示不同酶之間對各個統一指標的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 料液比對水酶法提取葵花籽油的影響 由圖4知,隨著料液比的增加,各相含油量變化趨勢不大,料液比為1∶5時,游離油含油量最高,這可能是由于料液比過小時,漿液的粘度較大,體系的流動性較差,使得酶與底物不能夠充分結合。料液比過大時,稀釋了酶與底物的濃度,會影響酶的作用速度,從而影響游離油含油量。最終,選擇料液比為1∶5。這與文獻中報道的料液比不能過大也不能過小相一致[4]。

圖4 料液比對水酶法提葵花籽油的影響Fig.4 Effects of solid/liquid ratio to the aqueous enzymatic extraction of sunflower seed oil注:a,b,c,d字母表示不同料液比之間對各個統一指標的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.3 反應時間對水酶法提取葵花籽油的影響 由圖5可明顯看出,酶解2 h游離油含油量最高,渣相含油量最低。這主要是因為隨著酶解時間的不斷延長,細胞壁的結構會進一步的被打破,酶作用于底物的效果會越好,釋放的游離油會越多。但酶解時間也不宜過長,酶解到一定時間,由于底物大部分被酶解,剩下的底物就會減少,釋放的游離油就不會進一步的增加,而且游離油在不斷的攪拌、溫度等條件作用下會加劇乳化現象。過2 h后,酶解時間越長,游離油含油量有所下降,乳狀液含油量增多。

圖5 反應時間對水酶法提葵花籽油的影響Fig.5 Effects of Reaction time to the aqueous enzymatic extraction of sunflower seed oil注:a,b,c,d字母表示不同反應時間之間對各個統一指標的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.4 酶添加量對水酶法提取葵花籽油的影響 由圖6知,隨著酶添加量的增大,游離油含油量在不斷上升,乳狀液含油量在不斷下降,酶添加量為2%時,游離油含油量最高,渣相含油量較高。酶添加量越高,酶與底物的作用就越完全。因為酶有破乳作用,釋放出更多油脂[21]。由圖6知,隨著酶添加量的增大,游離油含油量在不斷上升,乳狀液含油量在不斷下降,酶添加量為2%時,游離油含油量最高,渣相含油量較高。高于1.5%時,隨著酶添加量的增大,游離油含油量提高不明顯,渣相含油量增加也不明顯。考慮到生產成本,選擇酶添加量為1.5%。

圖6 酶添加量對水酶法提葵花籽油的影響Fig.6 Effects of enzyme additive amount to the aqueous enzymatic extraction of sunflower seed oil注:a,b,c,d字母表示不同酶添加量之間對各個統一指標的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 葵花籽原料及水酶法加工產物的激光共聚焦顯微鏡觀察

從圖7的A中可以明顯看出初粉后的物料仍有完整的細胞結構,精粉一次后的物料B中完整的細胞結構被破壞,由圖B～E可以看出,隨著精粉次數的增多,細胞破碎程度更加徹底,油脂溢出程度也在增加,初粉后精粉三次、四次的油脂溢出率隨之增大,水酶法提油時乳化嚴重。

圖7 不同粉碎方法后葵花籽仁的激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.7 CLSM-image analysis of sunflower seeds of different crushing method注:黑色為油脂,灰白色為蛋白質。A為初粉后的物料;B為初粉后精粉一次的物料;C為初粉后精粉二次的物料;D為初粉后精粉三次的物料;E為初粉后精粉四次的物料。

從圖8中很明顯看出加酶反應的乳狀液油滴體積較大,含量較少,容易進行破乳操作,可使總提油率提高。從水相和渣相來看,很明顯可以看出加酶后的水相和渣相中殘留的油脂含量較低。這主要是因為加酶后,對葵花籽仁細胞破碎更徹底,油脂釋放更完全。

圖8 葵花籽水酶法加工中所形成各相的激光共聚焦顯微圖像Fig.8 CLSM-image analysis of the sunflower seed of the aqueous enzy matic extraction process注:黑色為油脂,灰白色為蛋白質。a、b、c分別為不同相的CLSM圖像。a-1為加酶后的乳狀液,a-2為相同條件下未加酶的乳狀液。b-1為加酶后的水相,b-2為相同條件下未加酶的水相;c-1為加酶反應所得的渣相,c-2為相同條件下未加酶反應所得的渣相。

2.4 水酶法提取葵花籽油的理化指標

表2中列出了葵花籽油重要的理化指標,水酶法制得的葵花籽油與市售葵花籽油進行比較并無明顯差別,均符合國家標準。而且水酶法僅經過脫酸和脫色的精煉步驟,與壓榨油相比,簡化了精煉步驟,降低了精煉的成本。

表2 葵花籽油的理化指標Table 2 Physicochemical characteristics of sunflower seed oil

2.5 葵花籽油的反式脂肪酸含量

為了更全面地認識水酶法葵花籽油的特征,還檢測了其反式脂肪酸含量,并與市售的3種壓榨油進行對比,結果如表3所示。

反式脂肪酸主要與溫度和加熱時間有關系,反應溫度越高,加熱時間越長,反式脂肪酸的總含量就越大[18]。從表3中可以看出,水酶法制取的葵花籽油中反式脂肪酸含量較低,說明水酶法提葵花籽油的工藝條件較溫和,制取所得的油品質較好。

表3 葵花籽油的反式脂肪酸含量(g/100 g)Table 3 Trans fatty acid content of sunflower seed oil(g/100 g)

3 結論

粉碎方式直接影響水酶法提取葵花籽油的效果,經過精粉的物料粒徑更小,分布更均勻。在初粉條件下,精粉二次的葵花籽物料平均粒徑能夠達到19.68 μm,游離油含油量最高。通過單因素實驗優化了其他的酶解工藝參數,確定了水酶法提取葵花籽油的最佳工藝,即:葵花籽原料粉碎至平均粒徑19.68 μm,料液比1∶5 (w/v),1.5%的堿性蛋白酶,反應時間2 h。在最佳工藝條件下,游離油含油量可達92.48%。

與市售冷榨法油相比,水酶法得到的葵花籽油均達到了冷榨油的品質,在反式脂肪酸含量方面甚至低于冷榨油。