沙棗花揮發性物質的分析及特征香氣成分的鑒定

,,,煜晨,

(石河子大學食品學院,新疆石河子 832000)

沙棗花為胡頹科植物沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)的花。沙棗主要分布在西北干旱地區,新疆沙棗屬于地中海地區沙棗的后代,是現代胡楊、灰楊和白榆等群落的伴生植物[1-2]。新疆沙棗花期大致在5月份,南疆地區5月中上旬開花,北疆地區5月下旬開花,花期20 d左右,因品種、氣溫不同,而略有差異[3-5]。沙棗花能夠釋放獨特的香氣物質,具有“飄香沙漠的桂花”的美稱[5-7]。對沙棗花芳香成分的分析已有許多報道,主要集中在沙棗花精油的提取工藝上,對于特征香氣分析的研究較少。研究新疆沙棗花特征香氣成分,分析不同工藝、不同地區沙棗花的香氣差異,對研究呈香機理有一定的貢獻作用。

固相微萃取(Solid phase micro-extraction,SPME)是一種新型樣品預處理富集技術,廣泛應用于環境、藥物及各種食品風味的分析檢測中[8]。氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)作為分析揮發性風味物質的有效方法,已廣泛應用于食品風味、香精香料及調味品的揮發性風味物質分析[9]。氣相色譜-嗅聞技術(gas chromatography-olfactometry,GC-O)技術以人鼻作為感受檢測器,能夠快速準確的發現植物特征香氣的構成,并根據各香氣成分的氣味強度對總體香氣的貢獻進行排序[10]。主成分分析(principal component analysis,PCA)是將研究對象的復雜多指標問題通過特定方式的數據轉換,同時提供多變量整體化、數據變異方向、群點散布、數據點分布等信息,最終轉化為簡單且較少數量綜合指標的一種統計方法[11-14],可運用于對品種來源、植物香氣、加工工藝、分布區域進行分類及類別歸屬的判別,及在不遺漏重要信息的情況下分析鑒別影響樣本差異的關鍵變量。喬海軍等[4]利用水蒸氣蒸餾法提取沙棗花揮發油,采用GC-MS對其化學成分分離鑒定,結果鑒定出57種化合物可有效評價甘肅沙棗花的整體風味。經研究沙棗花揮發性香氣成分,主要成分為肉桂酸乙酯,還包括一些醛醇及雜環類物質。但到目前為止,對沙棗花的研究仍停留在揮發性物質的分析上,為了確定沙棗花特征香氣的主要貢獻物質及準確有效的評價和監控沙棗花產品,本研究以沙棗花為研究對象,采用5種不同方法對沙棗花揮發性香味物質進行提取,利用GC-MS對沙棗花揮發性成分進行定性定量分析、GC-O分離鑒定沙棗花揮發性香氣活性成分、結合主成分分析、香氣強度及感官評價確定其中特征香氣成分及相關性,為沙棗花的深度開發和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棗花 2016年5月下旬采摘于新疆石河子市145團,屬于地中海沙棗的后代;正構烷烴混合樣本(C6～C26) 購自上海國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑均為分析純 購自國藥集團化學試劑有限公司。

超臨界CO2萃取裝置 美國SepTech公司;Clarus 500;SPME萃取裝置 美國Supelco公司,75 μm CAR/PDMS;旋轉蒸發儀(RE52-98) 上海亞榮生化儀器廠;6890氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司,Supelco18275-06APTE-5Capillary柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);6890氣相色譜-嗅聞儀(GC-O) 美國Agilent公司；ODP2嗅聞端口 德國GERSTEL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 水蒸氣蒸餾法:準確稱取100 g自然陰干的沙棗花,置于1000 mL圓底燒瓶,按1∶5的比例加入蒸餾水進行蒸餾,餾出液采用分析純二氯甲烷萃取,萃取液用無水硫酸鈉干燥24 h后過濾,將濾液通過旋轉蒸發儀旋蒸濃縮,收集二氯甲烷溶劑,得到具有獨特芳香氣味的淡黃色液體即為沙棗花揮發油。放入4 ℃冰箱保存,盡快檢測。

索氏提取法:采用索氏提取器,準確稱取10 g磨碎的自然陰干的沙棗花,放入濾紙筒封口,置于索氏提取器,樣品高度接近虹吸管,平底燒瓶注入2/3體積的無水乙醇,置于45 ℃水浴鍋中進行回流,反復抽提2～3 h,至顏色變淡黃為止,再旋轉蒸發得到沙棗花揮發油,放入冰箱,盡快檢測。

真空泵抽取吸附采集法:將裝有Tenax TA的采樣管一端與空氣采樣泵連接,另一端深入保鮮袋中的沙棗花當中。啟動泵,空轉速率3 L/min,采樣時速率2 L/min,采集30 min使得沙棗花揮發性香氣物質吸附于Tenax TA填料上[14]。采集過程中不時翻動保鮮袋,使得揮發性香氣物質在保鮮袋中混合均勻。采集完畢后將采樣管密封包裝,兩天內采用熱解析儀和氣質連用儀對香氣成分進行分析。

固相微萃取:取自然陰干的沙棗花100 g,放入200 mL錐形瓶中,用封口膠將瓶口密封,固相微萃取器在采樣前先進行老化(將萃取器針頭插入GC-MS進樣口中,進行250 ℃高溫熱解老化30 min[15])。將老化后的萃取器針頭插入密封的盛有沙棗花的錐形瓶,在250 ℃下萃取40 min后立即拔出萃取劑針頭,插入GC-MS進樣口進行分析[16]。對液體樣品:稱取2 g氯化鈉加入20 mL頂空瓶中準確量取2 mL液體樣品加入頂空瓶中,然后加入磁力攪拌轉子,加蓋密封,將SPME針管穿透樣品瓶隔墊,調整插入長度,水浴45 ℃攪拌平衡15 min,45 ℃水浴條件下萃取吸附30 min取出手柄,直接進樣,250 ℃溫度條件下解吸3 min,每個樣品重復3次[16,18]。

超臨界CO2萃取:準確稱取100 g自然陰干的沙棗花裝入1 L的超臨界CO2萃取釜中進行萃取。萃取溫度45 ℃、萃取壓力24.83 MPa、萃取時間1 h。收集萃取的沙棗花揮發油,放入冰箱保存,盡快檢測[7]。

1.2.2 檢測條件 色譜條件:色譜柱為Supelco18275-06APTE-5Capillary柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);柱流量(恒流)0.8 mL/min;進樣口溫度250 ℃;進樣量為1 μL;分流比為20∶1;氮氣為載氣;采用程序升溫,初始溫度為60 ℃,然后以2 ℃/min的速率升到180 ℃,再以15 ℃/min的速率升到290 ℃(保持15 min)[19]。質譜條件:質譜的質量檢測范圍為29～420 aum;電子倍增電壓(EMV)為1435 V;電離電壓為70 eV;離子源溫度為230 ℃;四級桿溫度為150 ℃。

1.2.3 GC-O分析條件 除索氏提取法外其余4種方法提取出的樣品平衡30 min后進行分析,以合成干燥空氣為載體,流速200 mL/min;頂空參數:時間10 min,溫度50 ℃,攪動速度250 r/min;頂空注射參數:注射體積2500 μL,注射速度600 μL/s,注射溫度50 ℃,最后數據獲取時間180 s[20]。

1.2.4 感官評定 采用SPME提取沙棗花樣品中的揮發性成分。經GC-MS檢測,流出物在毛細管末端以1∶1的分流比流入嗅聞儀。嗅聞端口由8名經過提前培訓的感官評價員進行嗅聞評定實驗。本次實驗采用檢測頻率法分析不同提取條件下沙棗花特征香氣活性物質,即8名感官評價員對分析樣品中特定保留時間上的香氣成分香味呈現與否進行感官評定并記錄相應比率[21]。評價員檢測出頻率最高的香氣成分,對樣品風味影響最大。感官評定是研究香味物質評定項目不可或缺的部分。評價小組由經驗豐富、無吸煙史,年齡25～45歲的4名男性和4名女性評定人員組成,并按照標準培訓。所有感官實驗都在特定的感官評定室進行,每個樣品重復評價。評分方式采用10分制,0～2分,似有似無;2～4分,較弱;4～6分,中等;6～8分,較強;8～10分,非常強[22]。

1.3 數據分析

實驗數據處理由GC自帶Xcalibur軟件系統處理,將所測得各揮發物的譜圖與NIST2008和Wiley9譜庫中標準物質的譜圖比對,匹配度大于80%予以記錄。相似度分析采用Excel 2003軟件分析,聚類分析用于構建沙棗花特征香味物質樣本的篩選,主成分分析(PCA)用于對沙棗花和模擬沙棗花產品質量的監控,所有數據均進行3次平行試驗。RI:保留指數,氣相色譜定性指標參數。

2 結果與分析

2.1 不同提取工藝沙棗花揮發性物質GC-MS分析

為了建立能夠有效識別沙棗花特征香味的指紋圖譜,依據5種不同提取工藝及GC-MS測定的沙棗花樣本進行揮發性物質分析,結果如圖1。

圖1 各法提取沙棗花揮發性香味物質GC-MS圖譜Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds in flowers of E.angustifolia by different extraction注:a:水蒸氣蒸餾法,b:索氏提取法,c:真空泵抽取吸附法,d:固相微萃取法,e:超臨界萃取法。

如圖1a所示,水蒸氣蒸餾提取法,從基峰、相對峰度等方面進行比較,共鑒定出46種化合物,用峰面積歸一法確定各組分相對含量,主要成分為2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷、甲基環戊烷、環己烷、反式-肉桂酸乙酯。揮發性化合物主要以醇、酯、醛、酮、酸、烷烴類為主,其中酯類物質5種,醇類物質10種,酸類物質8種,醛類物質4種,酮類物質3種,烴類物質9種,酚類物質4種,其它物質3種。

圖1b索氏提取法提取的沙棗花揮發物中含38種化合物,其中酯類最多17種,醇類物質5種,酸類物質5種,醛類、酮類各2種,烴類物質3種,酚類物質3種,其它物質1種。含量最多的物質為反式-肉桂酸乙酯(43.33%)、二十烷基苯甲酸酯(8.88%)、2,3-丁二醇(6.21%)。

圖1c真空泵抽取吸附采集法提取的沙棗花揮發物中共檢測到69種化合物,其中檢測出酯類物質24種,醇類物質14種,醛類物質4種,酸類物質6種,酮類物質1種,苯環類物質5種,烴類物質6種,苯環類物質6種,其它物質3種。在5.5 min開始出峰,39.2 min出現最高峰,40.6 min出峰結束。其中含量比較高的物質是反式-肉桂酸乙酯(12.8%)、乙酸乙酯(7.7%)、2-甲基丁酸乙酯(7%)。

圖1d固相微萃取法提取的沙棗花揮發物質中檢測到36種化合物,其中烴類5種,酯類物質16種,醇類物質6種,醛類物質5種,酮類物質1種,其它物質3種。在1.48 min開始出峰,在26.43 min出現最高峰,44.34 min出峰結束。其中含量較高的物質有反式-肉桂酸乙酯(69.35%)、肉桂酸甲酯(17.32%)、苯乙烯(7.24%)。

圖1e超臨界CO2萃取法提取的沙棗花揮發物中共檢測到34種化合物,其中烴類物質5種,酯類物質18種,醇類物質5種,酸類物質3種,醛酮類物質各1種,其它物質 1種。在5.45 min開始出峰,在24.12 min出現最高峰,在40.47 min出峰結束。其中含量較高的物質有反式-肉桂酸乙酯(23.55%)、肉桂酸乙酯(10.48%)、肉桂酸甲酯(9.34%)。

2.2 不同提取工藝沙棗花特征香味物質聚類分析

由于提取方法的不同,其香氣組成與含量亦存在相應的差異,沙棗花采集時間不同,也會影響香味成分及特征香氣的篩選[23]。為了得到較為準確的特征香氣成分,本研究選用5種不同提取方法,按照GC-MS分析條件對其活性香味物質進行分析測試,將各色譜峰的峰面積與樣品號建立矩陣,剔除差異較大樣品[23]。聚類分析結果用樹狀圖表示,其中1、2、3、4、5分別代表水蒸氣蒸餾法、有機溶劑浸提法、真空泵抽取吸附采樣法、固相微萃取法、超臨界萃取法所提取的揮發性物質。

由圖2可知,1和3在最小距離水平上形成聚類,4和5在最小距離水平上形成聚類,因此,1和3之間具有最大相似性,4和5之間具有最大相似性。歐式距離增大到13左右時前兩個聚類合為一個大的聚類。隨著歐式距離的增大,當增至25.0時,2也并入其中。說明2與其余4之間相似度明顯較低,如果將其并入后續信息計算中可能對計算結果產生一定的影響。因此,將2剔除,選取1、3、4、5進行GC-O及后面主成分分析等實驗。

圖2 沙棗花揮發性物質聚類分析Fig.2 Cluster pedigree diagram of active-volatile in flowers of E.angustifolia

2.3 沙棗花香味活性物質GC-O分析

采用GC-O技術嗅聞技術,對沙棗花揮發性物質進行分析,結果如表1。

表1 4種提取工藝下沙棗花揮發性香氣物質的含量和風味特征描述Table 1 The contents and flavor characteristics of aroma compounds in flowers of E.angustifolia by 4 extracted methods

續表

由表1可知,經3次重復試驗,4種方法提取沙棗花揮發物質種共鑒別出63種香味活性的物質,其中共有物質18種,其中醛類5種,酯類6種,酮類2種,醇類2種,酚類2種,烯1種,分別是葉醛、蘇合香烯、苯甲醛、己酸乙酯、辛醛、苯乙醛、苯乙酮、壬醛、苯乙醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、胡椒酚、丁香酚、肉桂酸甲酯、癸酸乙酯、反式肉桂酸乙酯、反式橙花醇、植酮。在所有揮發性香氣物質種具有明顯香氣特征的物質包括反式肉桂酸乙酯(蜜甜香氣)、肉桂酸甲酯(蜜甜香氣)、胡椒酚(辛香)、苯乙酸乙酯(花香甜香)、蘇合香烯(帖烯木香花香)、苯甲醛(苦杏仁香)可初步判定這些物質是沙棗花特征香氣物質的重要組成部分。通過GC-O分析可知酯類物質,尤其是反式肉桂酸乙酯對沙棗花整體香氣貢獻最高。因此,沙棗花的主要香氣特征為蜜甜香、花香、甜香、青草香、杏仁香及帖烯木香。由圖3可知沙棗花中酯類香氣強度值最大,主要呈現芳香,果香,對沙棗花整體香氣貢獻較大,醛類物質香氣強度較大,是沙棗花香氣的重要組成部分。

圖3 不同提取方法提取的沙棗花揮發性香氣物質香氣強度比較Fig.3 Intensity of flavor compnents in E.angustifolia by different extraction technology

2.4 不同方法提取條件下沙棗花香氣感官評價

感官評定人員對四種不同方法提取的沙棗花香氣特點進行分析,感官評定由圖4可知,沙棗花香氣屬性被描述為芳香味、果香、谷香、木香、甜香、堅果香、青香,與GC-O分析結果一致。

圖4 沙棗花香味物質人工感官評價雷達圖Fig.4 Radar profiles of flavoring substance in flowers ofE.angustifolia by sensory evaluation

不同方法提取條件下提取的沙棗花揮發性香氣之間在感官屬性方面存在一定差異。水蒸氣蒸餾法提取的沙棗花揮發油中谷香和木香的評分高于其他樣品,且整體香氣輪廓感官屬性強度最高。香甜味的整體評分都很高,且評分最高,說明香甜味最濃郁。

采用多重方差分析得到沙棗花揮發性物質在不同感官屬性上的差異[24],分析結果見表2。

表2 沙棗花樣品感官評定結果Table 2 Sensory evaluation results in flowers of E.angustifolia samples

由表2可知,沙棗花香氣不同提取方法在甜香上無法相互區分,沙棗花感官屬性中甜香分數最高,代表沙棗花在該屬性上具有較高的風味強度。方差分析表明四個不同品種之間沙棗花香氣屬性中整體香氣、木香、果香、谷香、青香均存在顯著性差異(p<0.05)。感官屬性中芳香、果香、甜香，作為沙棗花主體香氣較為突出,表示沙棗花香氣整體風味怡人。

2.5 不同工藝提取的沙棗花揮發性成分主成分分析

主成分個數提取原則為主成分對應的特征值大于1的前m個值,由圖5A可知,通過方差分解主成分提取分析可知,提取2個主成分,即m=2。用主成分載荷矩陣中的數據除以主成分相對應的特征值開平方根得到兩個主成分中每個指標所對應的系數。將得到的特征向量與標準化的數據相乘即可得出主成分的表達式。根據主成分綜合模型可算出綜合主成分值。圖5B所示,PC1(57.7%)、PC2(39.8%)累計方差貢獻率為97.5%,能反映不同提取工藝沙棗花揮發油樣品的整體信息,可通過在平面上顯示的各個圖譜的分布情況,達到對樣品進行識別的目的。圖5C可知,新疆地區沙棗花不同提取工藝提取的揮發油樣本在二維(PC1-PC2)空間投影中存在顯著差異,其中固相微萃取與超臨界萃取位于y軸左側,而真空泵抽取吸附采集和水蒸氣蒸餾位于y軸右側,因此不同工藝提取的沙棗花揮發油其揮發性成分存在一定的差異;4種不同工藝條件提取的沙棗花揮發性成分樣品聚集在不同象限,表明沙棗花揮發性成分不同工藝之間具有“相似性”又有“差異性”。

圖5 不同提取方法提取的沙棗花揮發性物質的GC-O檢測PCA圖Fig.5 PCA plots of different extraction in flowers of E.angustifolia by GC-O

由表3可知,沙棗花特征香氣的主要成分為反式-肉桂酸乙酯(甜蜜香氣)為第一主成分,約占特征香氣成分的65%～70%,其次苯乙醛(果香、花香)為第二主成分、苯甲醛(苦杏仁香)、肉桂酸甲酯(蜜甜香氣)、苯乙酸乙酯(花香、甜香)、苯乙醇(玫瑰花香)、苯乙烯(帖烯木香、花香)在GC-MS和GC-O中均有檢測到且相對含量較高,初步確定為沙棗花特征香氣的主要成分。

表3 沙棗花香氣成分綜合主成分值Table 3 Synthetic principal score of aroma components in flowers of E.angustifolia

3 結論

采用SPME-GC-MS、GC-O技術,以及感官評價、主成分分析方法,對沙棗花樣品的風味物質和風味屬性進行較全面分析,并確定了沙棗花揮發性風味物質共有63種,包括醇類、酯類、酸類、醛類和酚類等,不同工藝之間香氣物質種類和相對含量具有一定的差異,都具有各自的特點。其中超臨界萃取法經檢測酯類物質總量最高,如苯乙酸乙酯、肉桂酸甲酯、桂酸異丙酯等,其中反式肉桂酸乙酯在正常范圍內。水蒸汽蒸餾法提取的沙棗花揮發性物質中檢測到反式-肉桂酸乙酯含量占42.13%,酯類物質占總揮發性物質含量的52%;真空泵抽取吸附法提取的沙棗花揮發物中檢測到反式-肉桂酸乙酯含量占總揮發性物質的12.8%,酯類物質占總揮發性物質的62.5%;固相微萃取所得反式-肉桂酸乙酯含量最高,約占總量的63.35%,總酯類物質占總揮發性物質的62%。超臨界萃取檢測出其中反式-肉桂酸乙酯占23.55%,酯類物質占55.44%。

針對沙棗花特征香氣通過GC-MS與GC-O技術結合PCA數據分析手段建立了能夠真實反映沙棗花特征的指紋圖譜,用于檢測沙棗花產品的真假及質量。

新疆沙棗花揮發性香氣物質中肉桂酸乙酯含量較高,可作為提取肉桂酸乙酯的天然產物原料。沙棗花特征香氣的篩選,為工業開發沙棗花香精與沙棗花香水等相關產品提供了理論依據。本研究數據和分析可為今后的開發與利用提供參考。