29個品種棗葉的HPLC指紋圖譜研究

魏 亮 鄒 玲 吳翠云 白紅進*

(1 塔里木大學生命科學學院/新疆兵團南疆化工資源利用工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

現有研究表明，棗葉中有豐富的黃酮類[1]、多酚[2]、維生素[3]、金屬元素[4]、三萜類[5]、糖類、皂苷[6]等營養成分和活性成分，具有抗菌、抗氧化[7]、抗癌等生物活性，《中藥大辭典》稱其為“棘葉”，主治脛臁瘡，具麻醉作用[8]，也可做成棗葉茶[9]等茶飲。研究表明酸棗葉提取物有明顯的鎮靜、安神作用[10]。另外，民間也有用棗葉作為牲畜飼料，可絕大多數棗葉都沒有被采收，大都自然脫落后被用來焚燒肥田，對環境造成很大污染。棗葉具有很高的藥用價值和經濟價值，但目前檢索到有關棗葉的文獻都是有關其次生代謝產物如黃酮、多酚等含量的測定[11]，或者提取工藝的優化[12]，對棗葉資源的開發利用報道很少，本研究采用高效液相色譜法建立29個品種棗葉的指紋圖譜，并且做了相似度評價和聚類分析，為不同品種棗葉成分含量之間的差異鑒別及質量優劣的評價提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料與試劑

29個不同品種的棗葉均采集于新疆阿拉爾市(東經81°17′41. 61″，北緯40°32′23. 50″)塔里木大學園藝試驗站紅棗資源圃內多年生的棗樹葉片(見表1)，經植物科學學院吳翠云教授鑒定為鼠李科棗屬植物葉片。采集時間為2016年6月，采集的樣品經50℃干燥恒重后粉碎，過40目篩，密封，室溫儲藏備用(已留樣保存)。

表1 棗葉來源信息

1.2 儀器與設備

BS124S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent Technologies 1260分析型液相(美國安捷倫公司)；甲醇為分析純；乙腈為色譜純(美國Sigma公司)；娃哈哈純凈水。

2 試驗方法

2.1 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁對照品適量，置于2 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為1. 0 mg/mL的對照品溶液。0. 45 μm微孔濾膜濾過，4 ℃保存備用。

精確稱取蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、柚皮苷對照品，分別配制成 1. 0 mg/mL 的對照品溶液，用0. 45 μm微孔濾膜濾過，4 ℃保存備用。分別取配制的對照品溶液適量混勻，制成混合對照品溶液。

2.2 供試樣品溶液制備

精密稱取1. 0 g樣品置于三角瓶中，按照1∶30料液比加入70%的甲醇-水溶液[13]，在室溫下超聲提取20 min，離心，收集上清液，每個樣品取1 mL提取液過0. 45 μm的微孔濾膜，用來進行HPLC分析。

2.3 色譜條件

色譜柱為Ufavour HPLC Columns C18(4. 6 mm i. d. ×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0. 1%甲酸水(B)溶液為流動相；梯度洗脫程序：0～10 min：5%～20%(A)，10～20 min：20%～20%(A)，20～30 min：20%～50%(A)，30～35 min：50%～100%(A)，35～45 min：100%～100%(A)；檢測波長280 nm；流速1. 0 mL/min，柱溫25 ℃；經0. 45 μm微孔濾膜過濾后，進樣10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察

取S1樣品，按2.3色譜條件重復進樣5次，考察儀器精密度。

2.4.2 重復性考察

取S1樣品5份，按照2.2制備供試樣品溶液，按2.3條件進樣，考察方法的重復性。

2.4.3 穩定性試驗

取S1供試樣品溶液，按2.3條件，分別在0、2、4、8、24 h進樣，考察樣品及儀器的穩定性。

3 結果與分析

3.1 指紋圖譜方法學考察結果

3.1.1 精密度試驗結果

樣品連續進樣5次，測定的主要色譜峰的相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰的相對保留時間的RSD值在0. 04%～4. 5%之間，色譜峰峰面積的RSD值低于0. 28%，表明儀器的精密度良好。

3.1.2 重復性試驗結果

5份樣品測定的主要色譜峰的相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰的相對保留時間的RSD值在0. 11%～0. 28%之間，色譜峰峰面積的RSD值在0. 04%～2. 1%之間，表明儀器的重復性好。

3.1.3 穩定性試驗結果

結果顯示測定的主要色譜峰的相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰的相對保留時間的RSD值在0. 16%～0. 34%之間，色譜峰峰面積的RSD值在0. 19%～0. 54%之間，表明儀器的穩定性良好。

3.2 指紋圖譜的建立及相似度分析

3.2.1 混合對照品色譜圖(見圖1)及棗葉樣品的色譜圖圖譜(見圖2)

圖1 混合對照品色圖譜

圖2 棗葉樣品色譜圖

3.2.2 29個品種棗葉指紋圖譜的建立及相似度分析

將29 個品種的的棗葉制備成供試品溶液，按照2.3色譜條件進樣，將各個樣品測試所得的HPLC色譜圖的數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》進行分析評價，結果見圖3，表2、3、4、5、6。

圖3 29個樣品HPLC指紋圖譜

如圖3所示，對29個樣品進行指紋圖譜分析，標定了14個共有峰，分別是是1號(6. 51 min)、2號(9. 56 min)、3號(10. 33 min)、4號(10. 72 min)、5號(12. 36 min)、6號(12. 91 min)、7號(14. 39 min)、8號(18. 16 min)、9號(25. 36 min)、10號(25. 89 min)、11號(26. 25 min)、12號(26. 45 min)、13號(28. 19 min)、14號(28. 35 min)。峰面積較高的主要是1號、5號、8號和9號峰。

表2 29個樣品共有峰相對面積(1)

表3 29個樣品共有峰相對面積(2)

續上表

樣品峰號1234567891011121314S260. 1380. 0290. 0520. 1340. 3020. 0170. 0631. 0000. 5850. 1110. 0710. 0910. 0520. 048S270. 1150. 0300. 0440. 0190. 2550. 0170. 0271. 0000. 6150. 1000. 0640. 0390. 0250. 068S280. 1630. 0280. 0660. 0440. 3910. 0270. 0141. 0001. 2700. 1980. 0400. 1270. 0890. 163S290. 1270. 0190. 0360. 0210. 3980. 0120. 0611. 0001. 2360. 1980. 1180. 0470. 0510. 013

表4 29個樣品共有峰相對保留時間(1)

表5 29個樣品共有峰相對保留時間(2)

表6 29個樣品相似度評價

由表2～6可以看出，29個樣品個共有峰的相對保留時間漂移不大。由表3可見，不同品種棗葉的指紋圖譜相似度存在差異。根據與S30(對照圖譜[14])相似度的大小，可將樣品分為三類：Ⅰ類相似度為85%～91%，Ⅱ類相似度為92%～95%，Ⅲ類相似度大于95%；S1、S11、S17、S18、S24棗葉指紋圖譜相似度為85%～91%，為Ⅰ類； S12、S20、S23、S28、S29棗葉的指紋圖譜相似度為92%～95%，為Ⅱ類；其余的為Ⅲ類。相似度可以體現不同批次樣品間各成分在種類及其相對量上的整體相似程度。分析結果表明，29個品種棗葉樣品的成分和含量相似度較高，但仍然存在一定差異。

3.3 聚類分析

以 14 個共有峰的相對峰面積作為變量，運用SPSS19.0 數據處理軟件對29批樣品進行系統聚類分析，聚類方法為組間連接法，利用歐式距離作為樣品的測度，得到樣品的聚類分析樹狀圖，見圖4。根據樹狀圖結果，與上文相似度結果相比較，可將29批棗葉大致分為三類，樣品S1、S11、S17、S18、S24聚為一類，樣品S12、S20、S23、S28、S29聚為一類，其余的樣品聚為一類。說明同一產地不同品種棗葉的成分相似度較高，但存在一定差異，因為采摘的樣品是同一個批次，可考慮是否為品種之間的差異，其原因有待進一步研究。聚類分析的意義是將不同品種的棗葉進行類別的劃分，使得同一類中的元素之間相似性比其他類的元素相似性更強，可用于棗葉品質的綜合評價，為棗葉資源的開發利用提供參考。

圖4 29個樣品聚類分析樹狀圖

4 討論

本試驗通過對精密度、穩定系、重復性進行方法學考察，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于5%，這一結果表明該方法符合建立中藥指紋圖譜的技術要求。利用高效液相色譜建立了29個品種的棗葉的物質指紋圖譜，標定了14個共有峰，使用中藥指紋圖譜軟件進行分析，結果表明不同樣品之間相似度存在差異，根據相似度的大小，可以將不同品種的棗葉的質量分為三個等級。對29個品種棗葉的成分含量進行聚類分析，可將29 批棗葉分為三類，結果與相似度結果一致，說明本文所建立的指紋圖譜具有較好的穩定性與重復性，可以用于棗葉的質量控制，為棗葉資源的綜合利用提供參考。