甜高粱與苜蓿混合青貯過程pH和主要微生物變化規律的研究

· 江· ，3*

(1 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

甜高粱(sweet sorghum)是世界五大作物之一，起源于非洲，在非洲有500多年的栽培歷史[1-2]。由于其生長速度快，光合效率作用高，易栽培，適應性強，抗旱[3]，生物產量和經濟產量大特性[4]，甜高粱作為最具優勢的可再生生物能源作物之一，已受到有關專家和政府的重視，并被國家發展和改革委員會列入《可再生能源中長期發展規劃》[5]。甜高粱與甘蔗，玉米相比，能夠更有效地利用CO2，對肥料和水的需求更少[6-7]。作為飼料作物，制作青貯是目前甜高粱主要的應用形式[8]。

苜蓿(alfalfa)是重要的多年生豆科牧草，營養價值高，蛋白質豐富，適口性好，有牧草之王的美譽[9-10]。苜蓿地下根系比較發達，具有固氮和改良土壤的作用，苜蓿在改善生態環境，保持水土方面發揮著十分重要的作用[11-12]。苜蓿因中性洗滌纖維含量低、蛋白質含量高、干物質降解率高而被廣泛關注[13]，青貯可以很好的保存苜蓿的營養價值，但是苜蓿緩沖能值高，可溶性糖含量低，導致青貯難以成功[14]。

混合青貯是把兩種或兩種以上具有不同營養特性的牧草按一定比例混合，達到成功青貯或提高營養價值的一種青貯方法。由于甜高粱富含可溶性糖而蛋白質含量偏低，而苜蓿富含蛋白質而可溶性糖含量偏低，因此選擇甜高粱與苜蓿混合青貯更具優勢，二者混合青貯不僅可以解決苜蓿單一青貯不易成功的缺陷，而且還可以解決甜高粱青貯蛋白質含量偏低的問題，可以達到互補的優勢效果。

隨著畜牧業的快速發展，飼料不足已經成為限制畜牧業可持續發展的重要因素，然而青貯飼料為緩解這一難題提供了新的思路。有關混合青貯發酵過程主要微生物變化方面的研究已有文獻報道[15-16]，但有關甜高粱與苜?；旌锨噘A過程pH值和主要微生物變化方面的研究尚未見報道，因此，本研究以不同比例的甜高粱與苜蓿混合青貯為材料，研究分析混合青貯發酵過程pH值和主要微生物的變化情況，旨在為研究和開發優質甜高粱與苜?；旌锨噘A提供科學依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

甜高粱與苜?；旌喜煌壤那噘A飼料，甜高粱采自塔里木大學動物科學學院實驗站，苜蓿采自第一師五團。甜高粱與苜蓿青貯原料的化學成分見表1。

表1 甜高粱與苜蓿青貯原料的化學組成(%)

注：DM-干物質，WSC-可溶碳水化合物，CP-粗蛋白質，NDF-中性洗滌纖維，ADF-酸性洗滌纖維，ADL-酸性洗滌木質素。

1.2混合青貯飼料的制作及試驗設計

青貯方式為實驗室塑料瓶罐裝青貯，塑料瓶容積為1 L。將甜高粱與苜蓿按不同的比例進行混合青貯，甜高粱占比為0%、25%、50%、75%、100%，并將瓶內原料壓實密封，每種比例混合青貯飼料制作10瓶，放在實驗室避光保存備用。

分別在裝瓶完成后的第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d和60 d取樣檢測樣品中的pH值第1 d、5 d、11 d、20 d、30 d、45 d和60 d取樣檢測各樣品的乳酸菌、酵母菌、霉菌、好氧菌和大腸桿菌數量，每次處理取3個重復。

1.3試驗方法

1.3.1 pH值測定

稱取樣品5 g剪碎，加入45 ml無菌蒸餾水，在5 ℃條件下浸泡0. 5 h,待其充分浸泡后，用電子酸度計測定。

1.3.2 乳酸菌數量測定

采用MRS培養基[17]，分別接種10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于37 ℃培養24 h后進行乳酸菌菌落計數。計數時選取培養基上光滑，圓形的灰白色菌落進行計數。

1.3.3 酵母菌數量測定

采用孟加拉紅培養基[18]，分別接種10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于30 ℃培養24 h后進行酵母菌計數。計數時選取培養基上濕潤、光滑、不透明、大而厚的菌落進行酵母菌計數。

1.3.4 霉菌數量測定

采用馬鈴薯培養基[19]，分別接種10-5、 10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于25 ℃培養72 h后進行霉菌計數。計數時選取培養基上菌絲細長，菌落疏松呈絨毛狀面絮狀的菌落進行計數。

1.3.5 大腸桿菌數量測定

采用伊紅美蘭培養基[20]，分別接種10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于30 ℃培養24 h后進行大腸桿菌計數。計數時選取邊緣整齊、圓形、表面有光澤呈灰白色的菌落進行計數。

1.3.6 好氧菌數量測定

采用營養瓊脂培養基[21]，分別接種10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于30 ℃培養24 h后進行好氧菌計數。計數時選取邊緣整齊，菌落隆起，光滑的菌落進行計數。

1.4數據整理與分析

試驗數據采用Excel2007進行整理。整理后數據采用SPSS17.0統計軟件進行One Way Anova方差分析。

2 結果與分析

2.1不同混合比例青貯飼料青貯過程中pH的變化

5種不同混合比例青貯飼料青貯過程中pH的變化見圖1。由圖1可知，隨著青貯發酵時間的延長，5個處理組的pH值在青貯初期下降較快，中期較平穩，在青貯第45 d時，基本都下降到了4. 5以下，最后趨于4. 2，達到了良好青貯的標準[22]。甜高粱所占比例中50%和75%的混合青貯pH最接近優質青貯pH值。

圖1 不同比例混合青貯過程中pH的變化

2.2不同混合比例青貯飼料青貯過程中微生物數量的變化

2.2.1 乳酸菌的變化規律

青貯過程中乳酸菌數量隨發酵時間的變化如表2，隨著青貯發酵時間的延長，5種不同比例的混合青貯飼料中的乳酸菌數量迅速增加，25%的青貯飼料在青貯發酵的第11 d乳酸菌的數量達到高峰，為109數量級，50%、75%、100%在第20 d乳酸菌數量達到高峰，為109數量級，然后隨著青貯發酵時間的延長逐漸下降并趨于平緩，到青貯發酵的第35 d時，5種不同比例混合青貯飼料中的乳酸菌數量都穩定下來。

表2 不同比例混合青貯過程中乳酸菌數量的變化

2.2.2 酵母菌的變化規律

表3顯示，各比例青貯飼料的酵母菌數量隨著青貯時間的延長整體呈下降趨勢，0%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第11 d達到高峰，為109數量級，25%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第15 d達到高峰，為109數量級，50%、75%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第5 d達到高峰，為109數量級，100%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第11 d達到高峰，為1010數量級。

表3 不同比例混合青貯過程中酵母菌數量的變化

2.2.3 霉菌的變化規律

表4顯示，青貯過程中隨著發酵時間的延長，不同比例混合青貯飼料中霉菌數量均迅速減少至105數量級，其中0%的青貯飼料在第60 d時檢測不出霉菌的存在，75%和100%的青貯飼料中的霉菌數量在青貯發酵的第30 d左右幾乎檢測不到，25%的青貯飼料在青貯發酵的第45 d幾乎檢測不出霉菌的存在。

表4 不同比例混合青貯過程中霉菌數量的變化

2.2.4 大腸桿菌的變化規律

表5顯示，隨著青貯發酵時間的延長，5種不同比例混合青貯過程中大腸桿菌的數量大體呈先增加后逐漸減少的趨勢，直至最后檢測不出大腸桿菌的數量。0%、25%的青貯飼料中大腸桿菌數量在青貯發酵的第11 d左右達到高峰，為109數量級，50%的青貯飼料中大腸桿菌數量在青貯發酵的第20 d達到高峰，為109數量級。100%的青貯飼料中大腸桿菌數量在青貯發酵的第5 d左右達到高峰，為108數量級，到第45 d之后檢測不出大腸桿菌的存在。

表5 不同比例混合青貯過程中大腸桿菌數量的變化

2.2.5 好氧菌的變化規律

由表6可以看出，5種不同比例混合青貯過程中好氧菌數量的變化基本呈下降的趨勢，0%、25%和100%的青貯飼料中好氧菌數量在發酵第20 d出現高峰，0%和100%的青貯飼料分別在第60 d和45 d之后檢測不出好氧菌。

表6 不同比例混合青貯過程中好氧菌數量的變化

3 討論

3.1不同混合比例青貯飼料青貯過程中pH值的變化

pH的高低是青貯飼料能否成功的重要指標，它能反映出青貯飼料是否得到了很好的保存以及被腐敗菌分解的程度[23]，品質優良的青貯飼料pH為3. 8～4. 2[22]。青貯過程中pH越低，酸度越大，青貯飼料則更容易保存[21]。甜高粱和苜蓿混貯時，初期甜高粱中含有的大量碳水化合物轉化為乳酸，一定程度上抑制了苜蓿中含有大量蛋白質腐敗產生的腐敗菌的生長，導致pH值迅速下降。然后隨著青貯發酵時間的延長發酵程度減弱，此時乳酸菌受低pH值和自己所產乳酸的抑制逐漸下降并趨于平緩，直至穩定。本試驗中，75%的青貯飼料pH值下降較快，第45 d便降到4. 5左右，效果較好，使飼料中的有害微生物處于不活躍被抑制的狀態。楊云貴等[20]指出，玉米青貯飼料的pH值第2 d下降到4. 00以下，這可能與牧草的種類及青貯溫度有關。

3.2乳酸菌、酵母菌、霉菌、大腸桿菌和好氧菌數量的變化

在青貯飼料發酵過程中，乳酸菌是起主要作用的有益微生物，它在厭氧狀態下可以將原料中的碳水化合物轉化為乳酸[24]。在青貯原料切碎裝入青貯窖后，青貯飼料中乳酸菌的數量會很快達到109CFU/g或1010CFU/g鮮樣，在微生物的數量變化曲線上出現高峰。本試驗中，5種不同比例的混合青貯飼料中的乳酸菌數量迅速增加，25%的青貯飼料在青貯發酵的第11 d乳酸菌的數量達到高峰，為109數量級，50%、75%、100%在第20 d乳酸菌數量達到高峰，為109數量級，然后隨著青貯發酵時間的延長逐漸下降并趨于平緩。這與程銀華[24]，張慧杰等的研究結果相似。不同比例混合青貯pH值結果表明，25%，50%，75%的青貯飼料pH下降較快，第45 d時便降到了4. 5左右，這與其乳酸菌的變化趨勢基本是一致的。

酵母菌在厭氧條件下利用青貯飼料中的糖分進行繁殖，生成乙醇和二氧化碳，使飼料具有酒香味。有研究表明[23]酵母菌能夠提高干物質的采食量，調節瘤胃微生物、pH和VFA并且能夠提高奶牛的產奶量。但是在青貯飼料發酵過程中如果酵母菌劇烈繁殖是不利的，乳酸的降解會導致pH值的上升，從而引起其他多種有機物質的腐敗，還有可能會導致青貯飼料的二次發酵。本試驗中，5種不同的比例的混合青貯飼料中的酵母菌含量整體呈下降趨勢，0%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第11 d達到高峰為109數量級，25%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第15 d達到高峰為109數量級，50%、75%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第5 d達到高峰，為109數量級，100%的青貯飼料中酵母菌數量在青貯發酵的第11 d達到高峰，為1010數量級。不同比例甜高粱與苜?；旌锨噘A發酵過程中酵母菌的波動狀態可能與青貯原料的特性有關。

霉菌是飼料中的有害微生物，它能夠導致青貯飼料好氣性變質，它常存在于飼料的表層和邊緣與空氣接觸的部分，使飼料被污染，導致適口性下降，從而降低了飼料的營養價值。通常采用降低飼料的pH值和保證厭氧環境來抑制霉菌的生長。本試驗中，5種不同比例混合青貯飼料中霉菌數量均迅速減少至105數量級，其中0%的青貯飼料中的霉菌在青貯的第60 d左右幾乎檢測不到，75%和100%的青貯飼料中的霉菌數量在青貯發酵的第30 d左右幾乎檢測不到，25%的青貯飼料在青貯發酵的第45 d幾乎檢測不到。

大腸桿菌是一類兼性厭氧菌，它適應性廣，是一類與青貯飼料有關的腐敗菌，他們主要分解青貯飼料中的蛋白質和氨基酸，使青貯飼料腐爛變質，從而導致青貯飼料的飼喂價值降低，但是它不耐酸，當pH降低至4. 4時，可以抑制大腸桿菌的繁殖。所以在青貯過程中酸性環境可以有效地抑制大腸桿菌的生長發育。本試驗中，隨著青貯發酵時間的延長，5種不同比例混合青貯過程中大腸桿菌的數量大體呈先增加后逐漸減少的趨勢，直至最后檢測不出大腸桿菌的數量。

好氧菌由于在青貯的初期由于剛被切碎，細胞并未立即死亡，仍進行呼吸作用，以及在青貯初期由于空氣的殘留使得好氧細菌數量大大增加，但是隨著呼吸作用的繼續進行，殘留的空氣被消耗，好氧菌的數量也會逐漸減少，因此裝罐時空氣排出的程度對青貯品質影響很大，壓實良好的青貯飼料半小時內可以使環境含氧量低于0. 5%，青貯過程中要求環境含氧量最高不能超過1%，高于這個數值青貯的厭氧環境就會被破壞。本試驗中，5種不同比例混合青貯過程中好氧菌數量的變化基本呈下降的趨勢，直至檢測不出。

4 結論

4.1 在青貯發酵后的5 d時，各比例混合青貯的pH值下降速度較快，達到了5. 5左右；發酵的5～35 d期間，青貯pH下降速度緩慢；在55 d時，0%的甜高粱混貯pH最大，其它比例混合青貯基本降到了4. 2左右。

4.2 隨著發酵時間的延長，不同混合青貯中主要微生物的數量均呈逐步減少的趨勢，發酵至第11 d時，25%的青貯飼料中乳酸菌達到最高峰；50%、75%、100%的青貯飼料中乳酸菌數量在第20 d時達到高峰。之后乳酸菌數量緩慢下降，75%的青貯飼料中乳酸菌數量下降較慢且數量最多。綜上所述，75%的青貯飼料有利于甜高粱混貯飼料的制作。