大豆卵磷脂替代卵黃的稀釋液低溫保存綿羊精液效果

趙建清 王 杰 李 娜 高慶華, 3*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(3 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

無動物源性添加劑稀釋液的研究，可以提高無動物源性稀釋液的長期保存效果，以及對研發(fā)不含動物源物質(zhì)的羊低溫保存精液的新型稀釋液有很大幫助。無動物源性稀釋液易制成粉劑，降低保存條件，減少成本,且成分明確，即非動物源性添加劑稀釋液是今后研究的大方向。因為很多行業(yè)已經(jīng)制定了相關(guān)政策，限制使用動物性原料[1]。而傳統(tǒng)綿羊精液低溫保存稀釋液主要是以動物源性(卵黃)為抗冷保護劑，含動物源的精液保存液雖有比較理想的保護效果,卻也有一定的弊端。國外有研究稱精液稀釋液中的卵黃會與一種來自尿道球腺的蛋黃凝固酶發(fā)生作用，不利于精子細胞生存[2-3]。卵黃中對精子起保護作用的主要是卵磷脂[4-6]，研究以大豆卵磷脂(SL)替代卵黃的稀釋液，成為了現(xiàn)階段研究的熱點。大豆卵磷脂稀釋液不僅成分確定，而且適合規(guī)模化生產(chǎn)。目前綿羊精液稀釋液中添加大豆卵磷脂的報道較少，也還沒有統(tǒng)一的添加量，卵黃中卵磷脂的含量約為10%[7]，實驗室TRIS專利卵黃稀釋液中卵黃占比約為23%，則TRIS專利卵黃稀釋液中卵磷脂含量約為5%。本試驗擬利用TRIS專利稀釋液的基礎(chǔ)液，以添加5%濃度的大豆卵磷脂為中間濃度，設(shè)置不同濃度的大豆卵磷脂組，來進行其對綿羊精液低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 稀釋液的制備與儲存

以TRIS專利稀釋液為基礎(chǔ)，用大豆卵磷脂代替卵黃進行配制稀釋液，混合均勻，每5 mL分裝到試管中，在-80 ℃冰箱冷凍避光保存，稀釋精液前將稀釋液解凍備用。

TRIS專利卵黃稀釋液按照配方進行制備，并在-80 ℃冰箱冷凍避光保存。

1.2 精液采集與保存

試驗采用假陰道法采精，挑選12只3～4歲無繁殖障礙且體況良好的多浪羊盤羊高代雜交公羊，在采精前三個星期進行補飼。試驗中將稀釋液與采集的精液按照精液密度等溫混合，對稀釋后的精液進行活率檢測，活率達到0. 7以上，將分裝的試管放在37 ℃盛有水的燒杯中，水浴在冰箱中1. 5 h降溫至0～4 ℃以內(nèi)，并保存在冰水混合物中。

1.3 精液品質(zhì)鑒定

精子活率檢測：在冰箱中拿出試管需進行快速而輕的搖勻，取一滴精液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，先在顯微鏡下100倍視野中觀察精子，后在400倍下進行檢測，觀察精子活率并記錄。

精子頂體完整率檢測：吸取10 μL精液滴于載玻片的一側(cè)，用邊緣光滑的另一張載玻片呈一定角度接觸液滴，拉向另一側(cè)而制成抹片，經(jīng)8 min自然風(fēng)干后，在福爾馬林磷酸鹽固定液中固定15 min，之后水洗干燥，用姬姆薩染液對抹片進行染色90 min，再用蒸餾水沖洗與干燥，顯微鏡下觀察并記錄頂體完整的精子數(shù)。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 比較不同濃度大豆卵磷脂替代卵黃作為稀釋液中的防冷保護劑，在低溫保存不同天數(shù)精子活率情況。試驗共分6個組：(A1, 1. 25%; A2, 2. 5%; A3, 5%; A4, 7. 5%; A5, 10%)大豆卵磷脂組與TRIS專利卵黃稀釋液(C)組將綿羊新鮮精液稀釋分裝并低溫保存，在第0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d對精子活率與頂體完整率進行測定，選出大豆卵磷脂組中效果最優(yōu)組。

1.4.2 對234只母羊同期發(fā)情處理，用大豆卵磷脂效果最優(yōu)組與C組低溫保存至第9 d的精液(精子活率大于0. 5)對234只飼養(yǎng)管理條件一致，體況良好，無繁殖障礙的發(fā)情母羊進行人工授精，大豆卵磷脂效果最優(yōu)組(112只)、C組(122只)，用B超在第40 d檢測受胎情況。

1.5 統(tǒng)計分析

受胎率用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗，精子活率和精子頂體完整率用單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0. 05表示差異顯著，P>0. 05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時間的精子活率

由表1可知，自第6 d起A1組精子活率顯著高于A2、A3、A4、A5組(P<0. 05)，且精子活率隨著大豆卵磷脂濃度的增加而下降；雖然從第3 d開始C組平均精子活率高于A1組，但A1組與C組精子活率在各時間點差異均不顯著(P>0. 05)；各組稀釋劑低溫保存綿羊精液的精子活率隨著時間的延長而下降，但A1、C兩組精子活率在第9 d為0. 53±0. 06和0. 55±0. 03均大于0. 5，滿足鮮精輸精要求。

表1 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時間的精子活率

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05)，相同字母表示差異不顯著(P>0. 05)。

2.2 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時間精子頂體完整率

由表2可知，精子頂體完整率均隨各組稀釋液保存時間的延長而呈下降趨勢，且各組在第6 d到第9 d精子頂體完整率下降較快。雖從第1 d開始A1組頂體完整率稍低于C組，但A1組與C組精子頂體完整率在各個相同時間點差異均不顯著(P>0. 05)。

表2 各組稀釋劑低溫保存綿羊精液不同時間精子頂體完整率(%)

注：同列比較無字母出現(xiàn)差異不顯著(P>0. 05)。

2.3 兩組稀釋液低溫保存綿羊精液第9 d人工授精受胎率

由表3可見，A1組低溫保存綿羊精液，在第9 d人工授精112只，有72只妊娠，受胎率達到64. 30%；C組第9 d人工授精122只，有80只妊娠，受胎率為65. 60%。由此可以確定，大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液保存至第9 d的精液受胎率相近(P﹥0. 05)。

表3 兩組稀釋液低溫保存綿羊精液第9 d人工授精受胎率

注：同列比較無字母出現(xiàn)差異不顯著(P﹥0. 05)。

3 討論

從本試驗結(jié)果可以看出，1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液從保存時間，精子活率隨時間的變化規(guī)律，精子頂體完整率以及經(jīng)大豆卵磷脂稀釋液保存后的精液人工授精情況，都可以達到卵黃稀釋液的效果，因此1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液能夠進行綿羊精液低溫長時間有效保存。

大豆卵磷脂稀釋液是近年稀釋液研究的熱點，F(xiàn)orouzanfar等[8]在冷凍保存綿羊精液試驗中，發(fā)現(xiàn)用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黃，證明大豆卵磷脂可以替代卵黃。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低溫與常溫下保存綿羊精液，結(jié)果表明精子在卵黃中的運動性較差。本試驗在0 ℃冰水混合物中保存綿羊精液，發(fā)現(xiàn)使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黃保存精子效果顯著高于其他濃度(P<0. 05)，與蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最優(yōu)添加量有一定偏差。所以證明為了確保精子的運動處于最好的狀態(tài)，大豆卵磷的添加劑量必須有一定的限度。

本試驗A1組與C組精子活率在第12 d分別為0. 46±0. 09和0. 49±0. 07，試驗結(jié)果優(yōu)于孟娜娜等[11]，略低于陳曉麗等[12]49. 51±1. 08。在第9 d時，A1組的精子活率為0. 53±0. 06，說明大豆卵磷脂稀釋液在低溫保存綿羊精液9 d內(nèi)精子活率滿足輸精要求。A1組與C組在各個相同時間點精子頂體完整率差異均不顯著(P>0. 05)，A1組在第6 d頂體完整率為83. 1±1. 2，略低于王杰等[13]保存6 d頂體完整率。頂體完整率隨時間推移逐漸下降，且下降速率逐漸變大[14]，與本實驗結(jié)果相似。

本試驗低溫保存第9 d人工授精受胎率達到64. 30%與65. 60%，試驗結(jié)果優(yōu)于丁瑜[15]使用大豆卵磷脂冷凍稀釋液人工授精受胎率，可能是因為精子受到一定的冷打擊，精子的受精能力有所減弱。本結(jié)果表明大豆卵磷脂稀釋液對精子保存能力與TRIS專利卵黃稀釋液差異不顯著(P﹥0. 05)，大豆卵磷脂稀釋液能夠?qū)d羊精液低溫長時間保存。

本試驗在設(shè)計時，就以5%大豆卵磷脂濃度組為中間點，因為這與卵黃中卵磷脂的含量相當(dāng)，結(jié)果也證明了5%大豆卵磷脂組的保存效果，但試驗結(jié)果卻為1. 25%大豆卵磷脂濃度組更好，其原因可能是：大豆卵磷脂的濃度的高低會影響精子的活力和復(fù)蘇率，在較高濃度的溶液中對精子運動產(chǎn)生阻力較大，造成大量能量消耗，從而精子的存活率、活力等都大大降低。也可能是因為卵磷脂生產(chǎn)廠家、純度等不同以及不同品種之間具有一定差異造成。所以推測是否在1. 25%濃度下還有更優(yōu)的濃度組，需進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

A1組(濃度為1. 25%的大豆卵磷脂稀釋液)低溫保存綿羊精液精子活率均高于其他濃度組(P<0. 05)；A1組低溫保存綿羊精液精子活率第9 d(0. 53±0. 06)、12 d(0. 46±0. 09)與C組第9 d(0. 55±0. 03)、12 d(0. 49±0. 07)差異不顯著(P﹥0. 05)，且頂體完整率相當(dāng)(P﹥0. 05)；A1組低溫保存第9 d的精液進行人工授精,受胎率64. 3%與C組65. 6%差異不顯著(P>0. 05)。表明1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液能夠進行綿羊精液低溫長時間有效保存。