流行性乙型腦炎病毒C基因的克隆與表達

張雪萍 米麗開姆·托合提尼亞孜 童劍軍 何川川 余 娜 李有文*

(1 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300) (2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis type B)是由日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的一種蟲媒性人獸共患傳染病[1]。人和多種動物均可感染本病，以豬群感染最為普遍[1]。病豬多引起非化膿性腦炎，病人最主要特征是中樞神經系統受害而出現意識障礙、驚厥等神經癥狀[2]。本病被世界衛生組織列為需要重點控制的傳染病。

乙型腦炎病毒是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)[3]。病毒顆粒為球形，20面體對稱，病毒外層有纖突。其基因組長約11 kb，編碼3個結構蛋白(C、M、E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1,3]。C蛋白為病毒的衣殼蛋白，包裹病毒基因組，對病毒基因組起保護作用[3,4]，構成病毒衣殼，決定其形態。已有研究表明，黃病毒屬病毒的C蛋白不顯露在病毒顆粒表面，因此不能誘導宿主細胞產生病毒的中和抗體[5,6]。C蛋白主要參與病毒的組裝與復制：例如JEV復制得到的大量正鏈RNA有一半與C蛋白結合形成未成熟的病毒粒子[7]；此外C蛋白還具有非結構蛋白的功能，研究發現C蛋白也是JEV感染抗病毒治療的靶位點[8]。盡管如此，C蛋白的結構特點、作用機制及更多的生物特性還有待研究，因此本文克隆了JEV P3株的C基因，并表達了其蛋白，分析了其核苷酸和氨基酸結構特點，為進一步研究C蛋白的其他生物學功能和作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌種

乙腦病毒P3株基因組cDNA由華中農業大學曹勝波教授饋贈；感受態細胞E.coliDH5α、E.coliBL21、原核表達載體pET42b保存于新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×Utaq PCR Mix (北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA連接酶 (大連寶生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒 (北京天根生物工程技術服務有限公司)，NdeI、XhoI(Thermo公司)，DNA 純化試劑盒 (美國Omega公司)。Western blot 用DAB顯色劑 (武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 主要使用儀器

瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，F250經濟型加熱制冷循環器(優萊博技術(北京)有限公司)，ZWY-103B恒溫培養振蕩器、ZXGP-B2160隔水式恒溫培養箱(上海智城分析儀器制造有限公司)，全自動凝膠成像分析儀、HC高電流電泳儀、T100 Thermal Cycler梯度PCR儀、 Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、 Mini-Trans-Blot電泳轉印槽(Bio-Rad生命科學有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原核表達載體的構建

(1)C基因的PCR擴增

參考GenBank中乙型腦炎病毒JaOArS982 (NC001437) C基因序列，設計C基因對pET42b載體的特異性引物，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司進行合成。如表1 (下劃線為加入酶切位點：NdeI/XhoI)。

表1 C基因特異性引物

以乙型腦炎病毒P3株基因組cDNA為模板，用C基因的特異性引物進行PCR擴增。100 μL擴增體系：模板4. 8 μL，上下游引物各2. 4 μL，5×PrimeStar Buffer 20 μL，DNTP Mixture 4 μL， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.2 μL，dd H2O 65. 2 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、57 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、72 ℃10 min，30個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化回收(按照DNA回收試劑盒操作)。

(2)C基因與質粒的酶切與純化

取C基因20 μL，pET42b質粒15 μL分別于兩個離心管，分別加通用10xBuffer 4 μL，NdeI2 μL，XhoI2μL，加入水至40 μL，充分混勻后，放入37℃ 水浴鍋中酶切3～4 h。酶切產物利用DNA純化試劑盒純化，保存備用。

(3) C基因與原核表達載體的連接與鑒定

將酶切純化的C基因5 μL與載體1 μL于同一離心管中，加T4連接酶1 μL，10xT4buffer 1 μL，加水2 μL，于16 ℃水浴連接8～10 h。將連接產物轉化入大腸桿菌感受態DH5α并涂板培養12～14 h，挑菌搖菌，做菌液PCR鑒定，PCR陽性菌提取質粒，并做雙酶切(NdeI/XhoI)鑒定，質粒送武漢天一輝遠生物有限公司測序鑒定。

1.2.2 P3株C基因核苷酸及推測的氨基酸序列分析

C基因的測序結果利用軟件DNAMAN和DNASTAR進行核苷酸同源性比較和遺傳進化關系分析。并推測其氨基酸序列，做蛋白二級結構分析和分子量預測。

1.2.3 C蛋白表達及鑒定

(1)C蛋白的表達

取經鑒定構建正確的質粒1 μL，轉化大腸桿菌感受態BL21，挑取單菌落后按正常蛋白電泳鑒定的方法鑒定，具體參考張孝忠等[9]的操作方法。

(2)Western Blot檢測

對C基因的表達產物進行SDS-PAGE電泳。將膠塊鏟下，切成合適大小，置于用TBST Buffer浸泡濾紙上，其上蓋同樣大小的用TBST Buffer浸泡NC膜，其上再加濾紙。然后置轉膜儀中，調電壓至120 V，電泳30 min，將蛋白轉至NC膜上。以His單抗為一抗，RHP標記的羊抗鼠抗體為二抗，用Western blot的常規操作方法進行檢測，具體參考張孝忠等[9]的操作方法。

2 實驗結果

2.1 C基因的擴增

JEV P3株C基因的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果如圖1，C基因大小約381 bp，與理論大小相符。

圖1 C基因PCR擴增

2.2 C基因的克隆與鑒定

構建的JEV C基因的克隆經菌落PCR鑒定，得到約381 bp的條帶，初步鑒定克隆成功；其質粒做NdeI/XhoI雙酶切鑒定，得到了約5 000 bp與381 bp(如圖2 )的兩條帶，與理論相符，說明成功構建了C基因的表達載體PET42b-JEV-C；質粒測序結果表明JEV P3株C基因與參考株同源性97%以上，且表達框正確。

圖2 重組質粒雙酶切鑒定

2.3 JEV-C基因及其遺傳進化特性分析

P3株C基因全長381 bp (如表2)，與對照JaOArS982同源性為97. 64%，其AT含量有50. 66%，序列中含有4個酶切位點(如表2左側畫橫線處)。

表2 JEV-C的核苷酸序列及氨基酸序列

根據P3株的測序結果，與GenBank中發表的JEV-C的序列做遺傳進化分析。對C基因進行遺傳進化樹分析(如圖3)，發現C基因雖然形成5個分支，但各分支之間差異較小，親緣性較近，說明JEV的C基因比較保守，這與其在病毒繁殖中重要的生物學功能相一致。P3株的C基因位于第IV組，遺傳距離約1. 5。

圖3 C基因遺傳進化樹

2.4 P3株C蛋白特性及二級結構分析

利用DNASTAR軟件分析JEV P3株C基因編碼127個氨基酸(如表2)，分子量大小13 KDa；從氨基酸組成上，25個強酸性氨基酸 (K,R)，5個強堿性氨基酸 (D, E)，53個疏水性氨基酸(A, I, L, F, W, V)，18個兩性氨基酸 (N, C, Q, S, T, Y)，等電點為11. 89，在中性環境中帶正電。C蛋白的二級結構分析 (圖4) 發現C蛋白主要由β片層結構和α螺旋結構構成，中間有少量的β轉角相連接。整個蛋白親水性一般，有較強的抗原性。

圖4 C蛋白二級結構分析

2.5 C蛋白的表達與檢測

質粒pET42b-JEV-C在大腸桿菌BL21中蛋白表達結果顯示：C基因以包涵體形式表達了大小13 KDa的蛋白 (如圖5)，與理論值相符；以His單抗進行Western blot檢測結果 (如圖6) 說明C蛋白與His標簽確實進行了融合表達，且表達結果正確。

圖5 C蛋白表達檢測

圖6 C蛋白的Western blot 鑒定

3 討論

JEV能夠引起包括人等多種動物神經系統的疾病，是引起公共衛生安全事件的主要病原之一。

JEV基因組是一條線形RNA正鏈，由5’非編碼區，蛋白編碼區和3’非編碼區組成，蛋白編碼區只有一個開放閱讀框編碼一個多聚蛋白，在宿主細胞和病毒編碼的蛋白酶共同作用下，將多聚蛋白切割成3個結構蛋白和7個非結構蛋白[10,11]。C蛋白是多聚蛋白N端的第一個蛋白，也是其中最小的一個蛋白，只有127aa，對病毒的組裝和結合病毒RNA不被降解有重要作用。本研究對JEV P3株C蛋白的二級結構分析發現其中間為一長的α螺旋結構(49-99aa)，其中含有大量兩性氨基酸，而兩端由多個β片層結構構成(如圖4)，富含荷電氨基酸，有利于結合病毒RNA。這個結果與Pareek等的研究結果一致。Pareek等研究發現C蛋白N端39aa，C端23aa對病毒的組裝無影響， N端16aa的缺失突變不影響病毒的組裝[12]，說明衣殼中環化序列不影響基因組的包裝或病毒的組裝，但影響病毒RNA 的復制。

JEV侵入宿主細胞之后，在酸性胞質中E蛋白結構改變釋放出病毒基因組，病毒基因組被運送到內質網中進行復制，合成病毒多聚蛋白和增殖RNA，C蛋白與新合成的RNA結合成未成熟的病毒粒子通過高爾基體成熟后釋放出細胞，整個過程均在細胞質中進行[13]。翟永貞等構建了融合表達GFP的JEV-C重組質粒轉染的CHO細胞，在細胞質和細胞膜中發現較顯著綠色熒光[8]，證明C蛋白可能確實與病毒的組裝有關，也說明病毒的增殖是在細胞質中進行的。但是有研究證明JEV-C蛋白可以特異性的和核仁蛋白B23結合，并且發現JEV-C蛋白與B23的結合位點是氨基端殘基Gly42和Pro43(表2右側劃橫線處)，說明JEV-C是可以進入細胞核的，并且其42、43位的氨基酸是重要的結合位點[14]。同時，Ma等[15]對JEV-C蛋白變異株(42、43位的甘氨酸和脯氨酸被丙氨酸替代)研究發現在核仁中找不到C蛋白，這一結果進一步證明該位點對C蛋白定位于細胞核作用重大。更多研究證明JEV-C蛋白在細胞核的定位對于臨床上病毒性腦炎的發病機制有著重要的意義[16]，也說明C蛋白除了作為結構蛋白之外還有更多非結構蛋白的生物學功能。本研究構建了pET42b-JEV-C的原核表達質粒，并成功表達C蛋白，說明JEV-C能夠在大腸桿菌中較好表達，為進一步研究C蛋白的結構及其他生物學功能奠定了基礎。