棉田Cry1Ac蛋白降解菌株12T-103的分離鑒定及降解能力研究

(塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

棉花(GossypiumhirsutumL.)是新疆農業的重要經濟作物和特色資源。轉Bt棉產生的Cry1Ac殺蟲蛋白可降低棉鈴蟲等害蟲的為害程度，減輕農藥對環境的污染。因其優勢,轉Bt基因棉種植面積日趨擴大[1]。但Cry1Ac殺蟲蛋白可經轉Cry1Ac基因作物根系分泌物或作物殘留等形式進入土壤生態系統，殘留于土壤而影響土壤微生物類群和多樣性[2]。Cry1Ac蛋白與土壤顆粒緊密結合不易降解[3]。轉Bt基因棉粉碎葉還土能促使土壤中細菌和真菌數量顯著增加[4]。Cry1Ac殺蟲蛋白對土壤生態環境的潛在安全風險也受到關注。

土壤生態環境也具一定抗風險能力。其土壤微生物可促進Bt蛋白的降解。從轉Cry1Ac基因水稻種植田土壤中得到降解Cry1Ac蛋白的細菌FJSB3，為寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.)，4 d內水稻秸稈中Cry1Ac蛋白降解率達到92. 86%[5-6]。新疆阿克蘇鹽堿地土壤細菌資源豐富，已分離培養鹽堿地土壤中的細菌103株[7]，但目前新疆棉田Cry1Ac蛋白的降解研究鮮有報導。因此對Cry1Ac毒蛋白的降解細菌進行篩選和鑒定將可對長期種植轉Bt棉田土壤的生態治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉田土壤：采集地為新疆建設兵團第一師十二團園林隊棉田，以五點法取樣法收集去除表層土壤2～3 cm后的土樣。

主要試劑：蛋白胨和牛肉膏(均購置北京奧博星生物技術有限責任公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，NaCl、H2O2、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、溴酚藍、甘油、甲醇和無水乙醇(均購置天津市致遠化學試劑有限公司)，瓊脂(海南省瓊海市長青瓊脂廠)，丙烯酰胺、過硫酸氨、甘氨酸(電泳級)、冰乙酸和考馬斯亮藍(R250)(均購置天津博迪化工股份有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，天津市鼎盛鑫化工有限公司)，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺(TEMED)(均購置天津市大茂化學試劑廠)，Cry1Ac蛋白(純度96%)及其酶聯免疫試劑盒(上海佑隆生物科技有限公司)。

NA培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0. 3%，NaCl 0. 5%，瓊脂1. 5%，pH 7. 2～7. 4。

NB液體培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0.5%，pH 7. 2～7. 4。

蛋白質電泳試劑：30%丙烯酰胺溶液(丙烯酰胺30 g，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺0. 8 g，去離子水100 mL，濾紙過濾于棕色瓶，室溫保存，pH小于7)；十二烷基硫酸鈉(十二烷基硫酸鈉SDS10 g溶于100 mL去離子水配制，室溫保存)；10%過硫酸氨(用去離子水配制少量10%(m/V)的貯存液，4 ℃保存，現配現用)；分離膠緩沖液(Tris-HCl pH8. 8：Tris 堿1.5 mol/L，用鹽酸調至pH8. 8)；濃縮膠緩沖液(Tris-HCl pH6. 8：Tris堿1. 0 mol/L，用鹽酸調至pH6. 8)；Tris-甘氮酸電泳緩沖液(Tris堿15. 1 g，甘氨酸94. 0 g，SDS 5. 0 g，加去離子水至1 000 mL，用時按1∶5稀釋，室溫保存)；考馬斯亮藍R250染色液(取0. 25%考馬斯亮藍R250 1. 25 g，溶解于500 mL混合液中，過濾并室溫保存)；脫色液(脫色液比例按甲醇∶去離子水∶冰乙酸=45∶45∶10，混勻室溫保存)。

1.2 主要儀器

蛋白質電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、恒溫恒濕培養箱(寧波賽福實驗儀器有限公司)、Sky-1102C 型全溫度恒溫搖床培養箱(上海蘇坤實業有限公司)、FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)、超純水機(成都優普生物科技有限公司)、PCR擴增儀(德國耶拿分析儀器股份公司) 。

1.3 試驗方法

1.3.1 Cry1Ac蛋白降解菌株的分離與純化

土壤細菌分離純化參照趙輝欣等方法[5-6]，將采集的土壤樣品均勻混合后稱取10 g溶于90 mL無菌水中，搖勻，將菌懸液用無菌水按10倍比例稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，并分別取各梯度稀釋液100 μL涂布于NA培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱，48 h后觀察。在培養基上用接種環挑取大小、顏色、形態各異的菌落，劃線分離后挑取單菌落純培養48 h。挑取純化后的單菌落1環接入NB液體培養基中，并置于恒溫搖床培養箱(37 ℃，200 rpm，48 h)，即為待測菌株。

1.3.2 Cry1Ac蛋白降解菌株的篩選

菌株降解Cry1Ac蛋白的方法參照趙輝欣等方法[5-6]。取培養的待測菌株1 mL，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL與Cry1Ac蛋白(16 μg/L)90 μL混合，水浴37 ℃，4 h。取反應液50 μL加入2×SDS上樣緩沖液，混勻后水浴100 ℃，5 min，取15 μL作為蛋白質電泳待測液。無菌蒸餾水作為空白對照。

蛋白質凝膠電泳方法[5-6]：(1)先制備8%分離膠，再制備5%濃縮膠；(2)用微量進樣器往凝膠梳孔中加蛋白質電泳待測液15 μL、標準蛋白Marker。(3)電泳先用電壓60 V 濃縮后進入分離膠，再增到120 V 至電泳結束。(4)采用考馬斯亮藍染色、甲醇-乙酸溶液脫色及凝膠成像。(5)降解菌的判別依據為蛋白質條帶有無表示Cry1Ac蛋白已被降解與否。

1.3.3 菌株的鑒定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》采用常規細菌鑒定方法[8]對菌株的形態觀察，通過對菌株16S rDNA分子檢測技術對其鑒定。首先取待測菌懸液3 mL，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，對細菌總DNA提取并作為PCR擴增模板，以16S rDNA擴增通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，循環35次；72 ℃延伸10 min[5-6]。PCR產物采用膠回收試劑盒純化后測序(由上海生工公司完成)。將測序結果與NCBI進行同源比較。

1.3.4 降解菌株對Cry1Ac蛋白降解能力的測定

取已篩選的待測菌株1 mL，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL與Cry1Ac蛋白(16 μg/L)90 μL混合，水浴37 ℃，于0 h、1 h、2 h時段取出樣品。采用酶聯免疫(ELISA)法定量分析Cry1Ac蛋白含量，分析降解菌對Cry1Ac蛋白在不同時間的降解作用能力。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據處理和多重比較(Duncan氏新復極差法)分析。

2 結果與分析

2.1 Cry1Ac蛋白降解菌株的分離與篩選

分離培養的100-111號菌株中，103號菌株處理無明顯電泳條帶顯示，而其他11種菌株均呈現不同亮度的電泳條帶(圖1)。經驗證表明12T-103菌株處理依然無明顯電泳條帶顯示(圖2)。這說明103菌株能明顯的降解Cry1Ac蛋白，命名為12T-103菌株。另外，Cry1Ac蛋白標準品、無菌水處理和各菌株處理均在70 kDa附近有明顯電泳條帶，Cry1Ac蛋白標準品分子質量約70 kDa。

圖1 Cry1Ac蛋白降解菌株的初步篩選電泳圖圖2 12T-103菌株降解Cry1Ac蛋白驗證電泳圖

(左至右，1為Cry1Ac蛋白標準品，2為無菌水處理，M為 (左至右，1為Marker，2～4為Cry1Ac蛋白標準品，5～7為Marker，3～14分別為100-111號菌株) 無菌水處理，8～10為12T-103菌株，11～13為12T-111菌株對照)

2.2 Cry1Ac蛋白降解菌株的特征及鑒定

表1 12T-103菌株菌落形態與生理生化特征

12T-103菌株菌落的形態特征為菌淡黃色，不透明，邊緣有一圈不規則裂紋，中央凸起(見圖4)，菌體特征為桿狀，產生內生芽孢(見圖4)。革蘭氏染色為陽性，接觸酶反應為陽性(見表1)。這表明12T-103菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。此外，利用細菌16S rDNA通用引物擴增12T-103菌株總DNA，擴增產物長度約1. 5 kb，將測序結果與NCBI進行同源比較得出12T-103菌株與Bacillussubtilis(登錄號KC441788.1)同源性為100%。由此鑒定12T-103菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 12T-103菌株分離及菌落形態圖4 12T-103菌株100倍油鏡

2.3 12T-103菌株對Cry1Ac蛋白降解能力的測定

表2 不同時間12T-103菌株對Cry1Ac蛋白降解含量的測定

由表2可知，在1h時12T-103菌株對Cry1Ac蛋白降解降較為明顯，由15. 95 μg·L-1降低至0. 68 μg·L-1，降低程度達極顯著水平(p<0. 01)，其降解率達92. 26%，此后12T-103菌株對Cry1Ac蛋白降解較為緩慢且不顯著。由此，12T-103菌株對Cry1Ac蛋白的降解能力較強。

3 討論

從12團棉田土壤中分離和純化82種菌株，經蛋白質凝膠電泳篩選出12T-103菌株對Cry1Ac蛋白降解能力較強，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其1 h的降解率達92. 26%。這與趙輝欣等報道降解Cry1Ac蛋白的細菌為寡養單胞菌(Stenotrophomonassp.)，4 d內稻秸稈中Cry1Ac蛋白降解率達到92. 86%[5-6]結果不同，因采集的水稻土壤細菌多樣性以及稻秸稈試材的不同而呈現不同結果。另外，本試驗未鑒定和分析棉田土壤其他菌株種類和降解能力，但從電泳條帶亮度可判斷，其他菌株也對Cry1Ac蛋白仍具不同程度的降解能力。轉Cry1Ac基因棉土壤中Cry1Ac蛋白的細菌降解種類和能力有待進一步研究。

此外，枯草芽孢桿菌對蛋白的降解能力較強。從養殖池塘底泥中分離的枯草芽孢桿菌也作為降解飼料蛋白菌劑，并采用紫外誘變提升蛋白酶活性[9]，通過高溫發酵提高發酵液中蛋白質的降解率[10]。另外，新疆阿克蘇鹽堿地土壤中可培養的優勢菌群為芽孢桿菌屬(36. 27%)、鏈霉菌(10.8%)、微球菌屬(6.9%)等[7]，采用變性梯度凝膠電泳分析芽孢桿菌目也為優勢菌群[11]，由此推測芽孢桿菌屬菌群對土壤中Cry1Ac蛋白降解可能具有較大貢獻。芽孢桿菌屬菌群與Cry1Ac蛋白降解特性還需深入研究。

4 結論

棉田Cry1Ac蛋白土壤降解菌12T-103為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，該菌對降解Cry1Ac蛋白能力較強，在1 h的降解率為92. 26%。