常規鈷60照射對膠原蛋白膜穩定性的影響

蘇佩清, 孫衛東, 蔣紅心, 喬 明, 周曉霞

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225000; 2. 揚州大學臨床中醫學院, 江蘇 揚州, 225000)

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最高、分布最廣泛的蛋白質，占人體或其他動物總蛋白的20%～30%[1]。膠原蛋白膜作為一種新型生物材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性及機械性能，在醫用生物材料領域得到廣泛的應用[2-3]。醫用材料要求滅菌處理，目前膠原生物材料常用的滅菌方法有環氧已烷滅菌法、射線輻照法等[4]。經醫用鈷60(60Co)輻照處理后，不僅能達到對膠原蛋白滅菌、交聯的效果，還能使膠原分子鏈斷裂變性。本研究探討常規60Co輻照滅菌方法對膠原膜性能的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 膠原蛋白膜的制備: 取新鮮牛肌腱，去除筋膜后冷凍切片, 37 ℃條件下采用胃蛋白酶消化24 h。將消化的腱片用0.5 mol/L醋酸溶脹、混勻，加飽和氯化鈉(NaCl)沉析膠原蛋白。透析沉淀液，提純膠原蛋白并保持其濃度為20.0 mg/mL, 注型成膜。

1.1.2 膠原酶液和胰蛋白酶液的配制: 膠原酶和胰蛋白酶購自Sigma公司，采用pH值7.4的0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液分別將膠原酶和胰蛋白酶配制成酶活力單位為20.0 units/mL膠原酶應用液和0.25% mg/mL的胰蛋白酶應用液。

1.1.3 實驗動物: 昆明種小鼠20只，體質量(30±2) g, 由揚州大學醫學院動物室提供，實驗動物使用許可證號為SYXK(蘇)2016-0019。

1.2 實驗方法

1.2.1 滅菌處理: 按照2000版《中華人民共和國藥典》中醫療器械輻照滅菌方法及《GB 18279-2000》中醫療器械環氧乙烷滅菌方法對膠原膜進行滅菌。輻照劑量率為22 KGy/h, 吸收劑量分別為5、10、15、20、25 KGy。

1.2.2 溶脹度測定: 應用打孔器將膠原樣品制成直徑1 cm的圓片，將膠原圓片初始重量(W0)的膠原膜浸泡于蒸餾水中0.5 h, 取出后用濾紙將膠原膜表面水分吸干，稱重(W)。溶脹度(S)=W/W0。

1.2.3 收縮溫度測定: 將膠原樣品切成1 cm×5 cm的長條，裝入盛有蒸餾水的燒杯中，從25 ℃升溫，升溫速度1～2 ℃/min, 當樣品明顯收縮時記錄溫度為收縮溫度。

1.2.4 酶解時間測定: 應用打孔器將膠原樣品制成直徑1 cm的圓片，之后將膠原圓片和膠原酶液(20 units/mL)或胰蛋白酶(0.25% mg/mL)加入小試管中，記錄37 ℃恒溫條件下酶解至樣品完全分解所需的時間為酶解時間。

1.2.5 膠原膜皮下埋植降解實驗: 無菌條件下，分別將照射滅菌(25 KGy)和環氧乙烷滅菌的膠原蛋白膜用打孔器制成直徑1 cm的圓片。將昆明種小鼠20只隨機分為環氧乙烷滅菌組和常規60Co照射組，每組10只。小鼠用乙醚麻醉后固定，背部正中消毒、去毛，手術剪開約1 cm的縱行切口，止血后用眼科剪分離皮膚與筋膜并將膠原膜片放入右側皮下，腸線縫合2針，小鼠清醒后正常飼養。分別于術后第10、20天斷頸處死小鼠，剪開皮膚觀察膠原蛋白膜片的降解情況，拍照留圖像資料。

1.2.6 掃描電鏡觀察照射前后膠原蛋白膜孔徑的變化: 揚州大學檢測中心代為檢測。

2 結 果

膠原蛋白膜經醫用60Co輻照處理前后的溶脹度和收縮溫度結果見表1。結果顯示，經不同輻照劑量60Co照射后的膠原蛋白膜溶脹度隨照射劑量加大而增加，不同輻照劑量膠原膜的收縮溫度隨照射劑量加大而減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。不同輻照劑量前后膠原膜的膠原酶和胰蛋白酶的酶解時間見表2。結果表明，膠原蛋白膜經不同輻照劑量的60Co輻照后，其抗膠原酶和胰蛋白酶的酶解時間較輻照前均減少，并與輻照劑量呈正相關，差異有統計學意義(P<0.01)。術后第10天觀察各組膠原膜片輪廓清晰，但常規60Co照射組的膜片明顯小于環氧乙烷滅菌組，說明常規60Co照射組膠原膜片的降解速率明顯快于環氧乙烷滅菌組。術后第20天觀察環氧乙烷滅菌組的膜片仍清晰可見并可完整剝離，而常規60Co照射組的膜片輪廓已不清晰，剝離時成型性差。見圖1。掃描電鏡圖顯示，照射過(25 KGy)的膠原膜與未照射過的膠原膜相比較，其孔徑明顯變大。見圖2。

表1 輻照前后及不同輻照劑量對膠原膜的溶脹度和收縮溫度的影響

與照射前比較, **P<0.01。

表2 不同輻照劑量對膠原膜和胰蛋白酶的酶解時間影響

與照射前比較, **P<0.01。

3 討 論

膠原蛋白膜作為一種新型生物材料，具有良好的生物安全性和可降解性[5-8]。醫用材料均需要消毒滅菌。射線輻照法具有操作安全、不污染環境、殺菌徹底無殘留、可對熱敏材料滅菌等優點[9]。

溶脹度可以反映膠原膜的交聯度，溶脹度越大表明交聯度越低[10]。本研究結果表明，不同劑量60Co輻照后，膠原蛋白膜的溶脹度均增加，并與輻照劑量呈正相關，說明常規60Co輻照后膠原蛋白膜的交聯度減少。掃描電鏡圖也能反映交聯度，本研究結果表明常規60Co輻照后的膠原蛋白膜孔徑變大，交聯度變小。

A. 環氧乙烷滅菌組第10天

B. 環氧乙烷滅菌組第20天

C. 常規60Co照射組第10天

D. 常規60Co照射組第20天

圖1 環氧乙烷滅菌組與常規60Co照射組術后第10、20天膠原膜片的降解情況

F. 照射25 KGy

圖225KGy照射膠原膜與未照射膠原膜的電鏡圖比較

收縮溫度可間接反映膠原熔點溫度，每一種膠原都有其特定的熔點溫度。膠原蛋白膜收縮溫度取決于膠原交聯程度和結晶度、膠原纖維的有序性、膠原的降解變性程度[11]。本研究結果表明，不同劑量60Co輻照滅菌后，膠原膜的收縮溫度均降低，這可能是由于采用常規60Co輻照滅菌膠原膜時，γ射線可造成肽鏈的斷裂，膠原纖維的有序性降低，膠原蛋白的空間結構松散變性。因此采用常規60Co輻照滅菌法，而不采用任何保護膠原蛋白膜的措施，膠原蛋白將因降解變性而遭到一定程度的破壞。

膠原酶和胰蛋白酶的酶解時間可反映膠原蛋白膜交聯度[12]。有研究[13]報道，經常規60Co輻照膠原膜的交聯度和穩定性增加。本研究結果顯示，常規60Co輻照后的膠原蛋白膜的體外酶解時間均減少，并與輻照劑量呈正相關。將膠原膜在小鼠皮下埋植10、20 d后觀察可見，與環氧乙烷滅菌比較，60Co照射的膠原蛋白膜的降解速率明顯加快。體內、體外實驗結果表明，常規60Co輻照后可使膠原膜的交聯度減少，穩定性降低，明顯加快了膠原蛋白膜的降解速率。

在輻射能的作用下，聚合物大分子鏈既可以發生交聯反應，也可以發生分子鏈的降解反應。發生交聯還是降解主要取決于聚合物的結構和輻照方法。有研究[14]報道，在低溫條件下，膠原膜經60Co射線輻照處理，在一定的劑量范圍內(15～25 KGy)膠原膜的交聯度增加，膠原分子的有序性增加，抗膠原酶酶解能力增加，穩定性增加。Magda J等[15]研究表明，適當劑量的γ射線輻照可以顯著提高濕態膠原蛋白膜的交聯度，對結構的破壞很少。但是對干態樣品，則會引起膠原蛋白的變性和有序結構的破壞。

本研究結果表明，60Co輻照滅菌處理的膠原蛋白膜的交聯度下降，分子穩定性降低，其分子結構的降解程度與輻射劑量呈正相關。