核仁紡綞體相關(guān)蛋白1在結(jié)腸直腸癌中的表達及臨床病理意義

蔣浩海, 肖 鋒, 顧春燕, 周林森, 高一飛, 穆向明

(1. 江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 鹽城, 224001;2. 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院 病理科, 江蘇 南通, 226006)

核仁紡綞體相關(guān)蛋白1(NuSAP1)是一種微管結(jié)合蛋白，主要表達于增殖細胞，其mRNA和蛋白水平在G2/M期到達峰值，此后迅速下降，在紡錘體組裝中發(fā)揮重要功能，是保證細胞周期正常進行的重要調(diào)控分子[1]。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中存在NuSAP1過表達，其表達水平與腫瘤的增殖和侵襲有關(guān)。本研究探討NuSAP1在結(jié)腸直腸癌中的表達及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年12月—2015年12月南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)腸直腸癌(CRC)患者標(biāo)本116例，經(jīng)患者知情同意，并通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定、常規(guī)組織學(xué)處理、石蠟包埋、5 μm厚度組織切片、蘇木精-伊紅(H&E)染色。收集上述樣本中14例癌組織及相應(yīng)癌旁組織新鮮標(biāo)本, -80 ℃凍存，本組病例年齡31～89歲，男80例，女36例。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

按Trizol(美國Invitrogen公司)說明書抽提組織總RNA, 紫外分光光度儀測定RNA濃度并定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。NuSAP1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海英駿生物工程公司合成。NUSAP1: 上游引物5′-TCATTTCCTTTTCTTGCCTCA-3′, 下游引物5′-CCCTCAAGTACAGTGACCTGC-3′。GAPDH: 上游引物5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′, 下游引物5′-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3′。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)條件為94 ℃下5 min, 94 ℃下45 s, 60 ℃下1 min, 32個循環(huán), 72 ℃下10 min。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定

通過檢查相應(yīng)的H&E染色切片，選擇CRC代表性組織塊進行免疫組織化學(xué)染色，采用Envision二步法，參照試劑盒說明書(上海基因科技有限公司)進行。實驗設(shè)陽性和陰性對照。陽性信號定位于細胞核，采用“雙盲”法進行評定。顯微鏡下評估陽性染色細胞的百分比和染色強度。染色強度分級: 0, 無染色; 1, 輕度染色; 2, 中度染色; 3, 強染色。陽性染色細胞的百分比分級為: 1為0～25%, 2為>25%～50%, 3為>50%～75%, 4為>75%～100%。將染色陽性的腫瘤細胞百分比評分乘以染色強度評分，最后的評分0～4分為低表達, 5～12分高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 NuSAP1 mRNA在CRC組織、癌旁組織中的表達水平

檢測NuSAP1 mRNA在14例CRC組織和癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示NuSAP1 mRNA在癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)。CRC組織中NuSAP1的相對表達量為(1.34±0.44), 而癌旁組織中相對表達量為(0.77±0.26), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測NuSAP1蛋白在CRC組織中的表達及細胞定位

進一步運用免疫組化法檢測NuSAP1蛋白在116例CRC組織中的表達情況，結(jié)果顯示NuSAP1蛋白陽性信號定位于細胞核(圖1)。NuSAP1蛋白在116例CRC組織中低度陽性表達67例，高度陽性表達49例; NuSAP1蛋白在116例CRC癌旁組織中均呈低表達。NuSAP1蛋白在CRC組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.01)。

2.3 NuSAP1表達與結(jié)腸直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析NuSAP1與CRC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示NuSAP1蛋白表達與CRC分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期高呈顯著正相關(guān)(P<0.01), 與CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、部位、Ki-67增殖指數(shù)無顯著相關(guān)性。見表1。

A: NuSAP1表達于細胞核，顯示中分化腺癌低表達水平(50倍); B: 圖A局部放大，顯示少量癌旁細胞核陽性表達(200倍);C: 圖A局部放大，顯示癌細胞核陽性表達(200倍); D: 顯示NuSAP1在低分化腺癌組織中高表達水平(50倍);E: 圖D局部放大，顯示癌旁組織中少量細胞核陽性(200倍); F: 圖D局部放大，顯示癌組織高表達(200倍)
圖1免疫組化檢測NuSAP1在CRC癌組織和癌旁組織中的表達和定位(Envision二步法)

表1 NuSAP1表達與結(jié)腸直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

與同一參數(shù)另一亞項比較, **P<0.01。

3 討 論

NuSAP1的正常表達對于維持正常細胞周期是很重要的[3], 其高表達會導(dǎo)致微管聚集成束，造成多種細胞的M期阻滯。謝萍等[4]利用NuSAP1基因特異性探針在人類56種正常組織中進行斑點雜交，顯示NuSAP1高表達于胸腺、胎肝、骨髓等免疫組織及造血組織中，而在腦、成人肝、腎等組織中幾乎無表達。Vanden等[5]報道敲除NuSAP1基因會導(dǎo)致小鼠胚胎致死, NuSAP1基因敲除的細胞中紡錘體不能正確組裝而使細胞周期持續(xù)停滯于分裂期，最終導(dǎo)致細胞凋亡，表明NuSAP1是保證細胞周期正常進行的重要調(diào)控分子。

微序列分析[6]表明與分化良好的纖維型星形細胞瘤相比，分化差、侵襲性強的膠質(zhì)母細胞瘤組織中的NuSAP1是一個過表達基因。在乳腺癌中, NuSAP1通過調(diào)控BRCA1蛋白的表達水平，能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生和進展[7]。在三陰性乳腺癌中, NuSAP1過表達提示預(yù)后差[8]。NuSAP1在肝細胞癌(HCC)中的表達情況也有少量報道, Satow等[9]研究表明，與非癌組織相比，患者HCC組織中也存在NuSAP1 mRNA表達的上調(diào)。張猛等[10]、Xie P[11]的研究顯示，在肝細胞癌組織中亦存在NuSAP1 mRNA及蛋白的過表達，并且與腫瘤的侵襲性及早期復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究顯示, NuSAP1基因和蛋白在CRC中的表達上調(diào)，與癌細胞分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與NuSAP1在星形細胞瘤和乳腺癌中的數(shù)據(jù)是相似的，表明NuSAP1可能參與相關(guān)腫瘤的分化、侵襲等過程。

在NuSAP1微管結(jié)合域存在2個細胞周期蛋白激酶磷酸化位點, NuSAP1磷酸化或去磷酸化狀態(tài)在細胞周期過程中受到精確的調(diào)控，并且對于細胞周期進程是至關(guān)重要的。在有絲分裂早期, NuSAP1被周期蛋白依賴性蛋白激酶1(CDK1)或細胞周期檢定點激酶(ATM)磷酸化，這種磷酸化阻止了NuSAP1與微管的連接，保證了微管結(jié)構(gòu)能夠維持動態(tài)變化; 在有絲分裂中期至后期轉(zhuǎn)換過程中, NuSAP1發(fā)生去磷酸化，去磷酸化NuSAP1能促進紡錘體中心區(qū)的形成，從而保證正常細胞周期進程[12-16]。細胞周期轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(E2F1)能夠通過結(jié)合NuSAP1啟動子而增加NuSAP1表達，進而促進前列腺癌細胞增殖; 過表達視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(RB1)或者抑制E2F1表達都能夠引起NuSAP1表達降低。上述結(jié)果表明, RB1是NuSAP1上游分子，可以通過RB1/E2F1信號途徑影響NuSAP1表達，進而調(diào)控細胞的增殖和侵襲能力[17-21]。

綜上所述, NuSAP1在CRC組織中高表達，可能參與CRC分化、轉(zhuǎn)移過程。進一步明確NuSAP1在CRC中的作用機制，將有助于認識NuSAP1在CRC中發(fā)揮的生物學(xué)功能，為臨床尋找新的治療靶點提供思路。