細(xì)胞凋亡抑制在子宮肌瘤發(fā)病機制中的意義

朱 麗, 貢子琦, 張雨婷, 陳書玲, 程 宏

(1. 江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 江蘇 蘇州, 215101; 2. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001)

子宮肌瘤(UL)也稱子宮平滑肌瘤，好發(fā)于30～50歲育齡期女性，是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤[1-3]。目前的研究[4-6]表明，子宮肌瘤的發(fā)病因素涉及遺傳因素、生長因子及其受體過度表達(dá)、細(xì)胞凋亡與增殖改變、類固醇激素及其受體表達(dá)異常增高以及一些其他因素。細(xì)胞凋亡是一種體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引起的細(xì)胞死亡過程[7-8]。細(xì)胞凋亡的特點是細(xì)胞沿著自身存在的程序結(jié)束其生命的主動死亡過程，具有特征的形態(tài)和生化改變，是由基因控制的個別細(xì)胞發(fā)生的自主有序的死亡，這和因外界因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起的細(xì)胞壞死有著本質(zhì)的區(qū)別[9-10]。

子宮肌瘤中出現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞增殖過度，一方面可能是由于細(xì)胞增殖力加強，另一方面也可能是由于細(xì)胞凋亡而受到了抑制[11]。雖然細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖完全不同，細(xì)胞凋亡也不能影響細(xì)胞增殖的能力，但細(xì)胞凋亡若受到抑制，就可使更多的細(xì)胞處于存活狀態(tài)，從而增加細(xì)胞的數(shù)量，也就間接地促進(jìn)細(xì)胞增殖。既往有關(guān)子宮肌瘤與細(xì)胞凋亡的研究多集中于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的mRNA水平，存在一定的局限性。本研究將重點放在蛋白質(zhì)水平，通過對比患者子宮肌瘤組織與正常組織中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平、Bcl-2/Bax比值及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和Caspase-9的活化狀態(tài)，分析細(xì)胞凋亡抑制在子宮肌瘤發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2016年10月蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮肌瘤而行子宮切除的住院患者20 例，年齡35～56歲，平均(45.00±5.45)歲。所有患者術(shù)前3個月未使用過類固醇類激素，術(shù)后即從肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織各1塊，稱重后置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｗ訉m切除后，標(biāo)本經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為子宮平滑肌瘤。子宮肌瘤組織設(shè)為研究組，同源正常子宮平滑肌組織為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA片段化分析[12]: 從液氮中取出子宮肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織，加入細(xì)胞裂解液(100.0 mmol/L Tris pH值8.0, 200.0 mmol/L NaCl, 10.0 mmol/L EDTA, 10.0 mg/mL SDS, 200.0 ng/mL RNase A), 37 ℃孵育1 h, 加入蛋白酶K至終濃度為300.0 ng/mL, 50 ℃溫育3 h; 采用等體積酚/氯仿和氯仿抽提后，取上清，加入1/10 體積3.0 mol/L乙酸鈉及2倍體積的無水乙醇以沉淀DNA, 采用70%乙醇洗滌DNA, 室溫干燥，加入TE, 取少量進(jìn)行15%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓2 V/cm。

1.2.2 蛋白樣本制備[13]: 從液氮中取出組織，反復(fù)研磨成粉狀，加入磁珠及裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)，手工勻漿5～8 min, 將組織勻漿液以12 000 轉(zhuǎn)/min、4 ℃下離心15 min, 離心后液體分3層，提取中間無色液相，置于-80 ℃長期保存或置于-20 ℃短時間保存。

1.2.3 蛋白濃度測定[14]: 本實驗采用改良Lowry′s法測定蛋白濃度(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2.4 Western Blot測定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]: 以2.5 g/L為標(biāo)準(zhǔn)，配置20.0 L蛋白上樣液, 100 ℃沸水中煮5 min; 制備聚丙烯酰胺凝膠，上樣后電泳; 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 將PVDF膜置于封閉液中室溫封閉2 h; 一抗4 ℃孵育過夜: 抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗P53抗體、抗活化型Caspase-3抗體及抗β-actin抗體等，抗體購自美國SIGMA公司及武漢博士德公司; 洗膜后二抗室溫孵育1 h; 再次洗膜后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影并觀察實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 子宮肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織

DNA片段分析

提取子宮肌瘤及瘤體旁正常平滑肌組織的DNA并做DNA片段化分析后發(fā)現(xiàn)，瘤體旁正常平滑肌組織中的染色體DNA出現(xiàn)斷裂，有明顯DNA ladder產(chǎn)生，而同時檢測的子宮肌瘤組織的DNA則未見明顯DNA ladder(圖1)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，研究組(子宮肌瘤瘤體)有5例出現(xiàn)DNA斷裂的梯形條帶(25%)，而對照組有15例出現(xiàn)200 bp左右階梯條帶(75%), 并且從斷裂條帶數(shù)量上看，研究組DNA碎片少于對照組。

a: 子宮肌瘤瘤體;b: 子宮肌瘤瘤體旁正常平滑肌組織

圖1子宮肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織DNA片段化檢測結(jié)果

2.2 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)分析

Bcl-2是Bcl-2家族中主要起抑制細(xì)胞凋亡的成員，而Bax則是Bcl-2家族中主要起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的成員，它們的表達(dá)量增加或減少與凋亡有密切關(guān)聯(lián)，尤其Bcl-2/Bax比值更能反映細(xì)胞凋亡的程度。與對照組相比，研究組中Bax的表達(dá)明顯較少，而Bcl-2的表達(dá)則明顯較高。見圖2。進(jìn)一步檢測所有樣本(n=20)的Bcl-2及Bax的表達(dá)，并由此計算Bcl-2/Bax比值，結(jié)果顯示研究組較對照組Bcl-2表達(dá)明顯增加，而較對照組Bax表達(dá)則明顯減少，研究組較對照組Bcl-2/Bax比值顯著增加(P<0.05)。見表1。由此可見，子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡的減少與Bcl-2及Bax的表達(dá)有關(guān)，尤其與Bcl-2/Bax比值有明顯關(guān)系。

a: 子宮肌瘤瘤體;b: 子宮肌瘤瘤體旁正常平滑肌組織;β-actin為內(nèi)對照
圖2子宮肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織Bcl-2及Bax表達(dá)檢測結(jié)果

表1 研究組與對照組Bcl-2、Bax表達(dá)及Bcl-2/Bax比值

Bcl-2表達(dá)指Western Blot檢測結(jié)果中Bcl-2/β-actin的灰度值;Bax表達(dá)指Western Blot檢測結(jié)果中Bax/β-actin的灰度值;與對照組相比, *P<0.05。

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Caspase-9的活化情況分析

與對照組相比，研究組中Caspase-3的活化明顯較少，活化的Caspase-3片段P17和P10僅有極少量; 同時，檢測Caspase-9的活化情況顯示，對照組中有非常明顯的Caspase-9活化片段P35出現(xiàn)，而研究組中雖有Caspase-9活化片段P35, 但量明顯不如對照組。見圖3。由此可見，子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中減少了細(xì)胞凋亡，而且這一抑制細(xì)胞凋亡過程與抑制Caspase-3和Caspase-9活化有關(guān)。

a: 子宮肌瘤瘤體;b: 子宮肌瘤瘤體旁正常平滑肌組織;β-actin為內(nèi)對照

圖3子宮肌瘤瘤體及瘤體旁正常平滑肌組織Caspase-3和Caspase-9活化檢測結(jié)果

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動自我殺傷的過程，這一過程需要特定基因及酶的參加。細(xì)胞凋亡早期就出現(xiàn)了核的改變，此時DNA斷裂并形成的200 bp片段及其整數(shù)倍的梯形條帶(每個核小體上纏繞的DNA長度即為200 bp), 這也成為細(xì)胞凋亡的特征性變化[16]。本研究采用了DNA片段分析來判斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，結(jié)果顯示瘤旁正常子宮肌組織出現(xiàn)凋亡較多，有明顯的DNA梯形條帶，而子宮肌瘤組織中出現(xiàn)凋亡則較少，且正常子宮肌組織DNA碎片明顯多于子宮肌瘤組織。本研究結(jié)果表明，與瘤旁正常子宮肌細(xì)胞相比，子宮肌瘤組織中的細(xì)胞凋亡明顯減少，細(xì)胞凋亡受到了抑制，進(jìn)一步說明子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展可能借助細(xì)胞凋亡抑制來實現(xiàn)。

在體內(nèi)，只有調(diào)節(jié)好細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的相互平衡才能維持機體正常的生理功能和細(xì)胞的狀態(tài)、數(shù)量，否則可能通過多種方式誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。惡性腫瘤的發(fā)生往往與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)聯(lián)。本研究中，除了檢測DNA ladder以外，還專門設(shè)定了與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測。有研究[17]發(fā)現(xiàn)在子宮肌瘤組織中凋亡抑制基因產(chǎn)物Bcl-2明顯高于周圍正常肌組織，但其主要通過研究mRNA水平或者免疫組化，缺乏蛋白定量或半定量水平的研究。本研究采用Western Blot的研究方法來分析Bcl-2、Bax的表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值，探討B(tài)cl-2家族在子宮肌瘤發(fā)生機制中是否起到作用。

Bcl-2基因家族是一個大的基因家族，既包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Ced-9等基因，也包括促進(jìn)凋亡的Bax、Bcl-xs、Bad、Bak等成員。細(xì)胞中高表達(dá)Bcl-2可使細(xì)胞減少或消除凋亡，有延長細(xì)胞壽命的作用，被稱為“長壽基因”。研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤組織中出現(xiàn)Bcl-2基因發(fā)生突變而導(dǎo)致過度表達(dá)，從而抑制了子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡，并使細(xì)胞生存的時間加長，導(dǎo)致了細(xì)胞堆積，并最終促使子宮肌瘤形成和發(fā)展。Bax最主要生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有抑制腫瘤、減少腫瘤發(fā)生的作用。在體內(nèi) Bcl-2與Bax蛋白以異二聚體形式結(jié)合來發(fā)揮作用，若體內(nèi)有很多Bcl-2蛋白同二聚體形成就會抑制細(xì)胞凋亡，而形成Bax蛋白同二聚體則會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2與Bax蛋白形成異二聚體時，Bax就可以發(fā)揮抑制Bcl-2抗凋亡的功能[18]。因此，Bcl-2與Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)的比例是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因素。本研究采用Western Blot的方法，從蛋白水平證明了子宮肌瘤瘤體的細(xì)胞凋亡抑制與Bcl-2較高表達(dá)及Bax較低表達(dá)有關(guān)，表明子宮肌瘤的發(fā)生可能與Bcl-2家族成員有關(guān)，且進(jìn)一步說明Bcl-2/Bax是一個很有價值的指標(biāo)，可以很好地分析細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，與凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。從功能來看, Caspase可分為兩類，一類是起始Caspase，另一類是執(zhí)行Caspase。起始Caspase受到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響被切割而得到激活，活化后的起始Caspase對執(zhí)行Caspase進(jìn)行切割并使之得到激活，被激活的執(zhí)行Caspase通過對其靶蛋白的水解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-9是一種起始Caspase，而Caspase-3是一種目細(xì)胞凋亡執(zhí)行Caspase。黎清等[19]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常子宮平滑肌組織, Caspase-3在子宮肌瘤組織中的表達(dá)明顯減少，說明子宮肌瘤的發(fā)生可能與Caspase-3表達(dá)的減少有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了Caspase-3和Caspase-9的活化，結(jié)果表明伴隨子宮肌瘤組織細(xì)胞凋亡的減少, Caspase-3和Caspase-9的活化減少，而由于Caspase-3的低表達(dá)或活化減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不能更多的啟動，也就促使子宮平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡障礙，因而不能及時清除異常細(xì)胞，最終抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生而造成細(xì)胞數(shù)量增加。由此可見，子宮肌瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制可能涉及對Caspase活化的抑制，尤其是抑制了Caspase-9這一起始Caspase，表明子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展很可能與抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑有關(guān)。

綜上所述，子宮肌瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡異常，尤其是細(xì)胞凋亡過度抑制有關(guān)，而且這一細(xì)胞凋亡抑制過程可能與Bcl-2/Bax升高有關(guān)，與抑制Caspase活化有關(guān)，并與抑制內(nèi)源性細(xì)胞凋亡有關(guān)。