中高溫大曲存儲后的感官質量研究

董大偉，王曉慧，蘇 葛，馬 偉，楊建梅，葉 紅

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

大曲通過自然接種和發酵，富集了大量有益于釀酒的微生物、各種酶類以及香味物質，在釀酒過程中起到驅動糖化、發酵和生香的重要作用。也正是如此，才有了俗語“曲為酒之骨”“曲定酒型”之說。為了確保和提升原酒品質，各酒企都制訂了相應的大曲質量控制標準，但都僅限于出房曲。大曲在用于釀酒生產前，必須經過3～6個月的存儲，減少乳酸菌、乙酸菌等產酸細菌的數量，使入池酒醅能夠符合前緩、中挺、后緩落的發酵工藝要求，達到增加酒體綿柔感的目的[1-2]，可見大曲存儲后的質量對釀酒影響更為直接。

大曲在存儲過程中受存儲條件的影響，會出現斷面發暗、霉變、裂縫、脫殼以及理化指標波動等現象，還有可能對釀酒以及大曲自身質量帶來影響，多數酒企都無相應標準對此進行科學管理和控制。現用曲（為方便閱讀，以下將存儲后的大曲稱為現用曲）的感官表象與出房曲相比有較大不同，如：斷面多數呈暗灰色、黑褐色，易出現裂縫、脫殼、霉變，蟲害嚴重等。為了對這些表象進行科學評價，達到全面管控的目的，本文以江蘇洋河酒廠的中高溫大曲為對象，利用高通量測序技術對現用曲感官質量進行研究和評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大曲樣品：不同表象的洋河中高溫現用曲。

5 g 1#斷面樣品：取自斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊的斷面部分。

5 g 2#斷面樣品：取自斷面呈暗灰色、淺褐色、欠泡氣的曲塊的斷面部分。

5 g 3#斷面樣品：取自斷面呈黑褐色、有生心、窩水的曲塊的斷面部分。

5 g 4#裂縫樣品：取自干裂曲塊的裂縫部分。

5 g 5#曲殼樣品：取自大曲樣品的曲殼部分。

1.2 實驗儀器

Miseq PE300平臺、美國ABI GeneAmp?9700型PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

將1.1中1#～5#樣品分別進行DNA提取，將樣品粉碎后加入到含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質,再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質,得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。

1.3.2 基因組DNA抽提

待基因組DNA抽提完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提和收集的基因組DNA。

1.3.3 PCR擴增

按指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物。隨機抽取樣本進行預實驗，以確保在較低循環數中能夠將絕大多數樣本擴增出適宜濃度的產物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個樣本3個平行樣，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測混合后的PCR產物，使用Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.4 熒光定量

根據電泳的定量結果，使用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統對PCR產物進行檢測定量，之后根據樣本的測序量要求進行相應比例的混合。

1.3.5 Miseq文庫構建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.6 Miseq測序

(1)DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上。

(2)另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋(bridge)”。

(3)PCR擴增，產生DNA簇。

(4)DNA擴增子線性化成為單鏈。

(5)加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成一個堿基。

(6)用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。

(7)將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端黏性，繼續聚合第二個核苷酸。

(8)統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.7 生物信息分析

Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質量控制和過濾，區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析。基于OTU聚類分析結果，進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度進行檢測；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計。綜合分析可以進行一系列群落結構和系統發育等深入的統計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 現用曲香味的分析

現用曲粉碎后與酒醅混勻入池發酵，經過發酵和蒸餾后，曲自身的香味會帶入酒體，與酒體中的其他香味物質結合，形成了白酒中綿厚怡人的復合香氣。所以，大曲的曲香味也是衡量大曲感官質量的重要指標。現用曲與出房曲相比，曲香味有著明顯的差別。剛出房的大曲香氣濃郁，但香味較雜，混有糧食味；經過一段時間的存儲通風排潮后，現用曲中的雜味逐漸消失，曲香更加純正、濃郁。但受霉變和蟲害影響，有的曲塊可能存在霉味、餿味和蟲屎味等。現用曲存在這些現象是由于儲存管理不當，未做好通風排潮工作導致。所以現用曲香味指標的評價應增加對以上異雜味的管控。我們根據分析形成表1現用曲香味評價標準。

表1 現用曲香味評價標準

2.2 現用曲斷面的分析

將1.1中1#、2#、3#斷面樣品按照1.3方法進行高通量測序，并對分析報告中的細菌和真菌群落結構組分（圖1、圖2）進行分析。斷面群落相對豐度情況見表2、表3。

圖1 斷面群落結構組分圖（細菌）

由表2可知，3個樣品的細菌群落結構差別較大，1#斷面樣品有益細菌占比最高，約93%，包括高溫放線菌屬、魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、（乳酸）片球菌屬、糖多孢菌屬、克羅彭斯特菌屬等，其中高溫放線菌屬占比約78%，能夠起到脫臭生香的作用[3]，優勢菌種明顯，反映出斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊不僅糖化發酵作用強，同時也具備較優的生香等功能；2#斷面樣品有益細菌僅占約35.4%；3#斷面樣品優勢菌種不明顯，其中乳酸菌類偏多，且雜菌種類較多，包括葡萄球菌屬、腸桿菌屬、腸道菌屬、藍細菌屬等。斷面呈暗灰色、淺褐色、欠泡氣的曲塊中有益菌占比較少，而斷面呈黑褐色、有生心、窩水的曲塊中雜菌較多，導致曲塊糖化發酵功能不穩定。

圖2 斷面群落結構組分圖（真菌）

表2 斷面群落相對豐度占比（細菌) (%)

由表3可知，3個樣品真菌群落結構基本類似，相對豐度占比有一定差別。其中熱子囊菌屬的相對豐度在各樣品中占比均最大，應是根霉屬類，曲霉屬與熱子囊菌屬相對豐度占比呈此消彼長的規律。根霉屬和曲霉屬中的有益菌功能類似，均主要起糖化作用。從真菌屬層面分析，還無法準確鑒別3個樣品的功能優劣。由于目前黃曲霉和青霉的研究較多，菌種的功能和危害性已有定性，這里不做進一步分析。

表3 斷面群落相對豐度占比（真菌） (%)

綜合分析認為，斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊不僅糖化發酵作用強，同時也具備較優的生香等功能，即依據大曲斷面菌絲顏色、泡氣性以及斷面生心、窩水、霉變等缺陷，能夠推斷出其功能性的優劣，驗證了傳統感官判定經驗的科學性。根據內容分析，現用曲斷面評價標準見表4。

表4 現用曲斷面評價標準

2.3 現用曲裂縫和脫殼的分析

曲塊在儲存過程中水分不斷散失，受物理作用容易出現裂縫和脫殼的現象，這種現象在現用曲中極為常見。為了研究裂縫和脫殼的影響性，我們采集了1.1中的4#裂縫樣品，進行高通量測序研究（見圖3、表5）。

由表5可知，4#裂縫樣品中含有高溫放線菌、魏斯氏菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、片球菌屬、糖多孢菌屬、短桿菌屬等有益菌占比約63%，其中高溫放線菌占比約39%，也存在雜菌過多的現象，群落結構好于3#斷面樣品；我們認為，裂縫的影響主要為雜菌感染，有益菌占比偏低。雜菌感染是由空氣中的微生物附著生長于曲塊裂縫表面造成。曲塊若出現脫殼現象也會引起相應問題。因此，當現用曲出現裂縫或脫殼現象時，應將以上影響進行考量。

圖3 裂縫處群落結構組分圖（細菌）

表5 裂縫群落相對豐度占比（細菌）

2.4 現用曲曲殼的分析

為了更好的分析曲殼厚度對質量的影響，我們采集了大曲樣品的曲殼部分進行基因測序（5#曲殼樣品5 g），但由于提取的DNA濃度較低，無法進行擴增和相關測序工作。可見曲塊的曲殼、火圈、斷面、曲心等部分中，曲殼的微生物含量最低。曲塊的主要功能是為釀酒提供酶類、菌源和香味成分，為了對曲殼進行評價，對曲塊各部分進行了分析，結果見表6、表7。

表6 曲塊各部分的香味品評

從曲殼的測序、香味品評和理化檢測[4]結果可以看出，曲殼的香味不足，具備較強的糖化和分解蛋白質能力，但曲殼中的糖化酶和蛋白酶主要來源于糧食種子自身而不是主要由微生物產生。我們對曲殼的分析結果：具備一定的糖化、發酵、分解功能，但缺乏菌源和香味成分，釀酒作用相較于火圈和斷面較弱，所以現用曲的曲殼不宜過厚。

2.5 現用曲蟲害的分析

夏季天氣炎熱，曲蟲會大量繁殖，給白酒企業帶來嚴重的危害。據統計,夏季曲蟲能吃掉大曲重量的30%～50%，造成釀酒用曲量的減少，不僅如此，還會造成曲塊糖化力、液化力、微生物總數的下降。蟲蛀嚴重的曲塊還會影響到大曲的曲香，破壞大曲的表面微生物群落結構及酶系，嚴重影響了大曲的質量。夏季曲蟲漫天飛舞，對環境衛生和工人身體健康也帶來不利的影響[5]。所以對現用曲的質量評價應增加蟲害控制要求。

2.6 現用曲感官標準

綜合以上分析內容，我們制定了現用曲感官評分標準（60分制），評分標準見表8。

表7 曲塊各部分理化檢測結果

表8 現用曲感官評分標準

3 結論

3.1 存儲期過后，受環境和自身影響，曲塊呈現出不同的感官表象，我們可以通過對現用曲感官的觀察，直觀地了解曲塊的質量情況，找出曲塊間的質量差異。

3.2 本文對大曲的香味、斷面、裂縫、脫殼、曲殼、蟲害等感官進行了系統的分析，可供釀酒行業制定現用曲感官評定標準時作為借鑒。

3.3 本文制定了現用曲感官評分標準（表8），僅供行業參考。