胰腺癌組織FOXC2的表達及其與預后的關系

陳吉祥， 陳金才， 黨勝春， 崔磊， 錢小寶

(江蘇大學附屬醫院胃腸外科， 江蘇 鎮江 212001)

根據最新流行病學統計數據顯示，胰腺癌死亡率在全球常見腫瘤中排第4位[1]。因診斷困難，難以早期發現，且惡性程度高，胰腺癌預后較差，患者5年生存率小于5%[2]。胰腺癌治療的關鍵在于早期診斷，但因為胰腺系腹膜后器官，早期病灶難以發現。目前一些臨床常用的腫瘤標志物雖然對胰腺癌的診斷、治療效果監測及預后評估起到了一定作用，但特異性和敏感性較低[3]。

叉頭框(forkhead box，FOX)家族是具有一段高度保守的DNA結構域的轉錄因子超家族，包含至少43個成員[4-7]，叉頭框C2(forkhead box C2，FOXC2)轉錄因子是人類forkhead家族的一個重要成員，與血管淋巴管的形成、肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗[8-10]以及2型糖尿病[11]等密切相關。另外，FOXC2在乳腺癌[12]、婦科惡性腫瘤[13-14]、食管癌[15]、胃癌[16]等多種惡性腫瘤細胞中呈過表達。進一步研究發現，FOXC2能夠使癌細胞獲得侵襲和轉移的能力，其與腫瘤的上皮-間質轉化密切相關[17]。然而，FOXC2在胰腺癌組織中的表達及其對各臨床指標的影響尚不清楚。本研究旨在通過檢測胰腺癌組織中FOXC2的表達，分析其與胰腺癌患者臨床資料的相關性，了解FOXC2對患者生存時間的影響。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌公共數據資料

利用Oncomine數據平臺，根據研究目的設定篩選條件：(1) Cancer Type：pancreatic cancer；(2) Gene：FOXC2；(3) Data Type：mRNA；(4) Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5) Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 主要試劑和材料

FOXC2小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗小鼠IgG二抗(上海倍卓生物科技有限公司)；山羊血清(鄭州九龍生物制品公司)；反轉錄試劑盒(上海Fermentas公司)；SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。

高速低溫冷凍離心機，酶標儀(美國Thermo公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；Real-time PCR擴增儀(美國ABI公司)。

1.3 患者信息及標本采集

收集2005年1月至2009年12月于江蘇大學附屬醫院普外科行胰腺癌根治術的112例胰腺癌患者癌組織及相應癌旁組織。納入標準：術前影像學檢查未見遠處轉移；術后病理學確診為胰腺導管腺癌；年齡30～85歲；術前均未接受放化療。其中，男63例，女49例，年齡35～81歲。癌旁組織取距離腫瘤邊緣2 cm以上[18]。以美國癌癥聯合委員會第八版胰腺癌分期系統作為臨床分期分級標準。本研究經江蘇大學附屬醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。所有患者隨訪至2013年12月。

1.4 實時定量PCR法檢測FOXC2 mRNA的表達

使用Primer 5.0設計引物序列。FOXC2：上游引物，5′-AGCTACATCGCGCTCATCAC-3′；下游引物，5′-CGTTCTCGAACATGTTGTAG-3′；GAPDH(內參)：上游引物，5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′；下游引物，5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。使用Trizol法從癌組織和匹配的癌旁組織中提取總RNA，將純化后的總RNA溶于40 μL DEPC水中。用反轉錄試劑盒合成cDNA文庫，反應體系25 μL，其中RNA引物12 μL，5×反轉錄反應緩沖液5 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，25 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，200 U/μL M-MLV反轉錄酶1 μL，Oligo(dt)18 μL，去離子水(不含RNA酶) 4 μL；反應程序：37 ℃ 60 min；85 ℃ 4 min；4 ℃ 5 min。PCR反應體系25 μL，其中SYBRTM熒光預混液12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，去離子水9.5 μL，cDNA模板2 μL(對照加入等量的去離子水)；反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。采用ABI Prism 7300 SDS 軟件分析數據，用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。每組實驗重復3次。

1.5 免疫組織化學染色檢測FOXC2蛋白的表達

取臨床胰腺癌組織和配對癌旁組織蠟塊標本進行連續切片，厚度為5 μm，吸附于防脫載玻片上。將切片置于溫箱中60 ℃烘烤1 h，二甲苯浸泡2次脫蠟；梯度乙醇水化；抗原高壓熱修復(0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液，pH=6.0)；封閉內源性過氧化物酶(3%H2O2溶液)，室溫下暗室浸泡30 min；室溫下血清封閉(含5 %山羊血清的PBS溶液)30 min；加入FOXC2小鼠單克隆抗體(1 ∶100)，加入等量PBS溶液代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；加入兔抗小鼠IgG(1 ∶500)，37 ℃濕盒中孵育2 h；PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色10 min，自來水漂洗終止顯色，蘇木精染液復染胞核。

陽性結果標準：顯現出邊界清晰，突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒；每張切片100×視野隨機挑選5個視野，根據每個視野陽性染色細胞比例行陽性細胞率評分(PS)。無，記為0分；1%～33%，記為1分；34%～67%，記為2分；67%～100%，記為3分。染色強度評分(IS)根據顏色由淺入深來劃分(0=無色；1=淺黃色；2=棕黃色；3=棕褐色)。PS與IS相加可得總分，0～2分判斷為陰性結果，3～6分判斷為陽性結果[19-20]。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 FOXC2 mRNA在胰腺癌組織中的表達

檢索FOXC2在Oncomine中的數據，共納入兩2項研究： (1) Badea Pancreas Statistics；(2) Pei Pancreas Statistics。Badea芯片數據中共有78例樣本，包括39例胰腺癌組織及對應的癌旁組織。Pei芯片數據中共有52例樣本，包括36例胰腺癌組織及16例胰腺組織。分析結果顯示，Badea和Pei芯片數據中胰腺癌組織FOXC2 mRNA表達量明顯高于癌旁組織(t=4.074，3.741，P均<0.05)。見圖1。

A：Badea胰腺癌芯片數據；B：Pei 胰腺癌芯片數據

2.2 FOXC2在胰腺癌組織中的表達

免疫組化染色結果顯示，FOXC2蛋白主要表達于胰腺癌細胞胞核(圖2)，且癌組織免疫組化評分明顯高于癌旁組織(t=7.571，P<0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，胰腺癌組織中FOXC2 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織(t=13.79，P<0.05)，見圖3。

2.3 FOXC2表達與患者臨床病例資料的關系

根據免疫組化評分結果，將0～2分列入FOXC2陰性組，將3～6分列入FOXC2陽性組。統計分析結果顯示，112例胰腺癌癌組織中，有84例表達為陽性(75.0%)；在癌旁組織中有26例FOXC2表達為陽性(23.2%)。FOXC2蛋白在癌組織中陽性表達率高于癌旁組織(χ2=60.1，P<0.001)。FOXC2蛋白在有淋巴結轉移的癌組織中陽性表達率高于無淋巴結轉移的癌組織(χ2=16.998，P<0.001)。在不同的TNM分期中，FOXC2陽性表達率差異存在統計學意義(χ2=19.193，P<0.01)；進一步兩兩比較顯示，胰腺癌Ⅲ期FOXC2陽性表達率明顯高于Ⅰ期(χ2=15.688，P<0.01)和Ⅱ期(χ2=10.678，P=0.001)。性別、年齡、分化程度、神經侵犯、脈管侵犯等對FOXC2的陽性表達率無明顯影響。見表1。

2.4 FOXC2表達與患者預后的相關性

生存曲線(圖4)顯示，FOXC2陽性組中位生存時間較FOXC2陰性組明顯縮短(P=0.001 3)，表明FOXC2陽性患者預后較FOXC2陰性者差。

Cox回歸分析結果顯示，FOXC2陽性表達(P=0.003)是判斷胰腺癌預后的獨立因素，FOXC2陽性表達患者與陰性表達患者相比，死亡風險更高(HR=2.569，95%CI：1.384～4.767)。

表1 FOXC2蛋白表達與胰腺癌患者臨床資料關系

圖4 FOXC2表達與患者生存時間的關系

3 討論

本研究通過檢索Oncomine數據庫發現，在Badea和Pei芯片數據中FOXC2 mRNA表達在胰腺癌癌組織中均顯著上調。此外，本實驗結果顯示FOXC2 mRNA在胰腺癌組織中的表達明顯高于相應的癌旁組織，證實FOXC2基因在胰腺癌組織中呈過表達，提示FOXC2可能與胰腺癌發展相關。

多項研究證實FOXC2表達參與惡性腫瘤的發生和轉移[21-22]，此外，研究表明，FOXC2誘導腫瘤細胞上皮-間質轉化，且貫穿于腫瘤侵襲和轉移過程[23-25]。FOXC2與食管癌[26]、胃癌[27]、結腸癌[28]、非小細胞肺癌[29]、原發性肝細胞癌[30]以及乳腺癌[31]的預后密切相關。Watanabe等[28]研究發現，FOXC2的表達與結腸癌淋巴結的轉移程度顯著相關，結腸癌患者中N2期者FOXC2的表達水平較N1期者明顯增加。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中FOXC2蛋白表達明顯增高，進一步證實FOXC2在胰腺癌組織中呈高表達，且FOXC2的表達水平與胰腺癌患者TNM分期、淋巴結轉移相關。由此表明，FOXC2陽性表達可能與胰腺癌侵襲和轉移能力相關，但尚待動物模型及細胞實驗進一步驗證。此外，本實驗結果顯示FOXC2陽性表達可作為判斷胰腺癌預后的獨立因素，對臨床具有一定指導意義。由于本研究病理組織來自同一醫院，可能存在選擇偏倚，上述結果尚需多中心研究進一步證實。

綜上所述，本研究證實FOXC2在胰腺癌組織中呈過表達，其參與胰腺癌腫瘤發生、發展和轉移，且與胰腺癌患者預后相關。