UNC-51樣激酶1在食管癌組織中的表達及其意義

劉欣韻， 蔣小芹， 鮑晶晶， 竇蓉蓉， 劉福興， 戴桂紅，朱曉蔚， 陳民， 于鴻

(泰州市人民醫院 1. 病理科， 2. 皮膚科， 江蘇 泰州 225300)

細胞自噬是一種廣泛存在于真核生物中的正常生理過程，一旦機體出現自噬過度或自噬不足都可以導致疾病的發生，自噬活性的改變與腫瘤的發生、發展密切相關[1]。真核生物中至少存在36種自噬相關基因[2]，其中哺乳動物中的同系物有兩種：UNC-51樣激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)和ULK2[3]。其中ULK1在細胞自噬過程中起著中心角色的作用[4]。近來研究顯示，ULK1表達與乳腺癌、肝細胞癌和食管癌等腫瘤預后密切相關[5]。本研究應用組織芯片技術對94例食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)及78例癌旁組織進行了分析, 以進一步驗證ULK1作為ESCC生物標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 對象和組織樣本

94例食管癌標本均來自本院2011年1月至2016年1月間手術病例，其中，男70例，女24例；年齡41～81歲(中值65歲)。所有樣本均經病理檢查診斷為鱗狀細胞癌。病理分級：Ⅰ級31例，Ⅱ級51例，Ⅲ級12例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期50例，Ⅲ期37例，Ⅳ期2例。34例有淋巴結轉移(36.2%)，腫瘤大小1.2～10 cm(中值4.5 cm)。所有患者在腫瘤切除前均未接受任何抗癌治療。本項目經泰州人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

1.2 組織芯片制備

食管癌組織芯片由上海芯超生物科技有限公司制備，具體制作方法參照文獻[6]。首先對每一個供體蠟塊進行切片和HE染色，顯微鏡下對所需穿取的目標組織定位，選取癌組織、癌旁組織共計172個位點(癌組織94個、癌旁組織78個)。利用組織芯片制作儀(Beecher Instruments公司)，依次從供體蠟塊上穿取直徑為1.5 mm的組織芯，插入有172點陣的受體蠟塊中，以4 μm的厚度連續切片。所得組織芯片的每個點都經過病理診斷。

1.3 免疫組織化學染色

63 ℃烤片1 h，常規脫蠟水化；使用EDTA熱修復法修復抗原20 min，水池中冷卻30 min；取出置于內源性過氧化物酶阻斷劑中15 min； PBS緩沖液沖洗3次；滴加兔抗人多克隆抗體(1 ∶30，DAKO公司)；冰箱4 ℃過夜；PBS緩沖液沖洗3次；滴加EnVisionTM+/HRP兔工作液(丹麥DAKO公司)，孵育30 min； PBS沖洗3次；DAB顯色，蒸餾水水洗終止顯色；蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗返藍；常規脫水、透明，中性樹膠封片；PBS代替一抗作為陰性對照，同時每張切片設置自身對照。

1.4 結果判定

1.4.1 組織芯片染色結果判定 將組織芯片中研究樣本充足、易于觀察的位點判斷為有效患者；而切片折疊、著色失敗以及觀察時未能找到癌細胞的位點，判斷為無效或無意義患者。在研究樣本中剔除無效或無意義患者。

1.4.2 免疫組織化學結果判定 染色強度結果： 無著色為0分，著色較弱為1分，著色適中為2分，著色較強為3分。ULK1陽性細胞的百分比分值：無陽性細胞為0分，小于20%為1分，20%～75%為2分，>75%為3分。染色強度和陽性細胞百分比積分兩者乘積得分>4時為高表達，≤4時為低表達。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。各組間顯著性檢驗采用四格表χ2檢驗。使用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析ULK1表達程度對食管癌患者生存期的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ULK1在ESCC和癌旁組織中的表達

成功構建172個位點的組織芯片(含94個癌組織位點及78個癌旁組織位點，圖1)。免疫組化結果顯示，ULK1在食管癌組織及癌旁組織中均有不同程度的表達(圖2)。ULK1蛋白主要定位在細胞胞質，少部分在細胞核中也有表達。在癌旁組織中，有40例不表達ULK1蛋白。根據上述結果判定標準，將表達ULK1的組織位點分為高表達組與低表達組。對食管癌組織和癌旁組織ULK1的表達進行χ2檢驗，結果顯示ULK1在食管癌組織胞質和細胞核中的表達均明顯高于癌旁組織(均P<0.01)。見表1。

圖1 含172個位點的食管癌及癌旁組織芯片

2.2 ULK1表達水平與ESCC患者病理特征的關系

ULK1表達高低與淋巴結轉移具有顯著相關性(P<0.05)。年齡、腫瘤大小、病理分級以及TNM分期等臨床病理特征與ULK1表達高低無明顯關系。見表2。

圖2 食管鱗狀細胞癌中ULK1的表達

分組細胞質細胞核癌組織癌旁組織癌組織癌旁組織高表達組442141低表達組26211014χ2值20.31610.411P值<0.01<0.01

表2 ULK1的表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 生存分析

ESCC患者的隨訪時間為0～61個月。94例ESCC患者的中位生存時間(median survival time，MST)為30個月。ULK1胞質高表達者MST為33個月，而ULK1胞質低表達者的MST為22個月(P=0.036，圖3)。ULK1低表達患者的生存率明顯低于ULK1胞質高表達者(危險比=1.754，95%CI1.022～3.010，P=0.041)。

圖3 ULK1不同表達水平患者的生存曲線

3 討論

哺乳動物細胞中的自噬過程分為3類形式：大自噬，小自噬，分子伴侶介導的自噬。其中大自噬作為一種強有力的降解機制，可將胞質中的蛋白分子甚至是整個細胞器降解消除，因此大自噬在腫瘤抑制和免疫方面發揮著最為重要的作用[7-8]。作為人類高保守自我保護機制，自噬通過選擇性破壞腫瘤細胞抑制腫瘤的進一步發展，而作為一種控制大自噬發生的重要激酶，ULK1 在惡性腫瘤的發生發展中扮演著極為重要的角色。Tang等[9]報道ULK1表達水平與乳腺癌患者的生存期呈正相關，高表達者生存期長，并且ULK1表達水平是乳腺癌患者的一個獨立預后因素。我們的前期研究卻發現肝細胞癌中ULK1高表達患者預后不良[10]。Jiang等[11]的研究顯示，相比于ULK1低表達ESCC患者，ULK1高表者預后較好。本研究結果也顯示，ULK1高表達的ESCC患者生存期顯著高于低表達者，與Jiang等研究結果基本一致。上述研究結果表明，ULK1在不同腫瘤細胞中可能具有不同的作用機制。隨著對自噬過程研究的深入，人們已經意識到自噬在腫瘤的發生發展過程中扮演著“雙刃劍”的角色，在不同的腫瘤類型、階段、微環境中，自噬既可促進腫瘤的發生發展，也可起抑制作用[12-13]。本研究結果顯示，ULK1在食管癌組織中的胞質和細胞核中的表達均顯著高于癌旁組織，ULK1的表達高低與淋巴結轉移及患者生存期顯著相關，提示ULK1在ESCC的發生、發展過程中起著重要作用。大量研究已經證實，腫瘤細胞的生長依賴血管的形成， 而ESCC是一種缺乏充足血供的實體腫瘤，但ESCC細胞的快速增殖又需要足夠的營養及氧氣，這就意味著ESCC細胞經常需要承受嚴重缺氧及代謝壓力，而自噬的活躍可以為癌細胞提供能量，降解細胞內毒性成分，維持癌細胞的代謝平衡，從而阻止癌細胞的凋亡及壞死發生[14]。因此，ULK1在食管癌組織中的表達顯著高于癌旁組織可能與上述機制有關。但本研究結果還顯示，與無淋巴結轉移患者相比，ESCC發生淋巴結轉移時的ULK1表達反而是降低的，即ULK1低表達的ESCC患者生存期顯著低于高表達者，我們推測可能與在ESCC不同分期階段，自噬發揮著不同作用有關，但具體機制有待進一步的深入研究。

發現和驗證各種新的用于腫瘤早期診斷、預后和個性化治療的分子生物標志物，已成為近年來腫瘤領域的研究熱點。本研究結果顯示ULK1在ESCC癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，ULK1表達水平與患者淋巴轉移情況和生存期相關，并且ULK1高表達的ESCC患者擁有更長的生存期，提示ULK1可能是ESCC潛在的分子標志物。但正如前述，自噬在腫瘤的發展過程中具有兩種相反的作用，ULK1的高表達并不一定意味著腫瘤的進行性惡性發展，ULK1在ESCC發生發展中的確切機制仍有待于進一步的研究。