循環腫瘤細胞對卵巢癌的診斷價值

張秀琳， 洪煜婧， 趙枰,*， 陳相， 周峰， 魯曉燕

(1. 南通市第一人民醫院檢驗科， 江蘇 南通 226001； 2. 南通大學公共衛生學院, 江蘇 南通 226001； 3. 南通市第一人民醫院婦產科， 江蘇 南通 226001)

近年來卵巢癌發病率不斷上升，且有年輕化的趨勢，是婦科病死率最高的惡性腫瘤。由于疾病早期缺乏典型的臨床癥狀，患者就診時多為晚期，雖經術后的聯合化療，但復發率仍很高，預后差[1-2]。糖類抗原125(CA125)是目前臨床用來診斷卵巢癌的主要腫瘤標志物，但對早期卵巢癌診斷的特異度和敏感度均不高，尤其是假陽性率較高。因此，如何提高早期卵巢癌的檢出率和診斷效率，是目前面臨的主要挑戰。1869年，Ashworth等[3-4]首次提出循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念，被譽為“實時腫瘤活檢”。本研究采用免疫磁珠為基礎的負性富集結合流式細胞技術，對卵巢癌、卵巢良性腫瘤及健康婦女外周血CTCs進行定量檢測，評價CTCs在卵巢癌診斷中的價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2015年6月至2016年8月本院收治經病理確診的卵巢癌患者65例，年齡41～71歲, 病理分期：按國際婦產科聯盟(FIGO，2014)的分期標準，Ⅰ期9例，Ⅱ期3例，Ⅲ期38例，Ⅳ期15例；同期卵巢良性腫瘤患者21例(囊腺瘤12、子宮內膜異位癥4例、巧克力囊腫3例、纖維瘤2例)；健康體檢者10例，年齡42～68歲，無惡性腫瘤史。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 術前靜脈穿刺抽血2 mL于無添加劑的干燥真空管中，Cobas e 601電化學發光免疫分析儀及原裝進口配套試劑(德國羅氏公司)檢測血清CA125濃度；7.5 mL于EDTA抗凝管中，24 h內進行下列檢測。

1.2.2 CTCs富集 Ficoll淋巴細胞分離液(上海朗頓生物科技有限公司)提取單個核細胞，加入少許紅細胞裂解液溶解混有的紅細胞，所得細胞與Miltenyi磁珠(德國Miltenyi Biotech公司)混合，加入已潤濕的LD柱中，在強磁場作用下收集未吸附的細胞組份(含CTCs)，LH750全自動血細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)計數、重懸。

1.2.3 流式細胞術檢測上皮細胞黏附分子(EpCAM)陽性的CTCs 單個核細胞懸液經固定、并加入透膜劑后，測定管加單克隆抗體CD45-APC、EpCAM-FITC(德國Miltenyi Biotech公司)，對照管加同型對照，避光孵育，PBS液洗滌，加入多聚甲醛，混勻、流式細胞儀(美國BD公司)檢測。每例樣本檢測(1～2)×104個細胞，重復3次，用BD AccuriTMC6軟件(1.0.264.21)進行數據采集和分析。以CD45-/EpCAM+細胞為CTCs，結果以外周血每106單個核細胞中EpCAM陽性細胞數表示外周血中的腫瘤細胞含量，即CTC單位為×10-6。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，以受試者工作特征(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)評估外周血CTCs檢測對卵巢癌的診斷效能。

2 結果

2.1 ROC曲線評估外周血CTCs檢測對卵巢癌的診斷效能

以術后病理診斷為“金標準”，以卵巢癌65例為疾病組，以健康體檢者10例及卵巢良性腫瘤患者21例為對照組(合計31例)，ROC曲線分析顯示，外周血CTCs檢測診斷卵巢癌的AUC為0.806(95%CI：0.722～0.890)，最佳臨界值為4.5(>4)個，敏感度為55.4%，特異度為96.8%，陽性預測值為97.3%(圖1)。同樣以術后病理診斷為“金標準”，以早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)12例為疾病組，以健康體檢者10例及卵巢良性腫瘤患者21例為對照組(合計31例)，應用ROC曲線分析，外周血CTCs檢測診斷卵巢癌的AUC為0.679(95%CI：0.473～0.884)，最佳臨界值為5.5(>5)個，敏感度為41.7%，特異度為100%，陽性預測值為100%(圖2)。

圖1 采用外周血CTCs區分卵巢癌患者和對照者的ROC曲線

圖2 采用外周血CTCs區分早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)患者和對照者的ROC曲線

2.2 血清CA125檢測對卵巢癌的診斷效能

以術后病理診斷為“金標準”，血清CA125水平的正常參考值為<35 U/mL，≥35 U/mL判為陽性，即診斷為惡性，各組病例血清CA125濃度見圖3。其診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的陽性預測值分別為61.5%和91.9%。

圖3 卵巢良性腫瘤和各期卵巢癌患者血清CA125濃度

3 討論

CTCs是指因診療操作或自發地從原發灶或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞，一般認為與腫瘤的轉移、復發密切相關。目前美國食品和藥物管理局(FDA)已經通過了對CellSearch系統的審核，應用于乳腺癌等患者外周血CTCs的檢測[5]。隨后一些學者應用該系統進行了多種惡性腫瘤的研究，結果表明CTCs對腫瘤早期篩查、轉移、復發監測、療效評價和預后判斷都具有特定的臨床應用價值[6-7]。但外周血中CTCs的含量極低，常規方法難以檢測。檢驗技術的不斷發展，使得分離、富集稀有CTCs成為可能[8]。

本研究首先采用密度梯度離心和紅細胞裂解的方法提取外周血中的單個核細胞，然后用負性富集的方法去除單個核細胞中的絕大部分CD45+白細胞；接著用流式細胞術檢測熒光標記的抗EpCAM特異性抗體以確定EpCAM+的細胞，認為CD45-/EpCAM+的細胞即為CTCs。國外有研究表明，用EpCAM作為標志可以在卵巢癌患者中確認CTCs并有較高的特異性[9]。我們的結果顯示，外周血中CTCs的含量對診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌特異度均較高，可作為一種液體活檢以提高對卵巢癌的診斷效率。與CA125相比，CTCs診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的陽性預測值均較高，可見CTCs檢測對早期卵巢癌表現出很好的診斷價值，但不可否認CA125在靈敏度方面表現更優，這與Michael等[10]的研究結果一致?？傊?，CTCs檢測在診斷卵巢癌方面具有較高的特異性和更好的陽性預測值，可用于卵巢癌的診斷。