腎脫細胞支架與再細胞化技術的研究進展

耿光瑞，李清剛，陳香美

解放軍總醫院 腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

腎移植是終末期腎病的首選治療方法，但腎源緊缺和移植后排斥反應等諸多難題始終難以解決。近年來，生物工程技術的發展與進步為器官功能重建與再生醫學注入了強大動力，使其有望成為解決腎移植難題的手段。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是細胞分泌的膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖、透明質酸和非膠原蛋白基質糖蛋白等物質，主要分布在細胞之間和膜表面，形成錯綜復雜的大分子網絡結構。脫細胞技術可以使細胞與組織有效分離，從而獲取我們需要的材料[1]，包括維持原有組織或器官形態并用于再細胞化的支架、組織貼片(如顆粒型或粉末型)、可注射凝膠、細胞培養液成分等[2]。理想的腎脫細胞支架應具備復雜的成分、血管網絡和獨特的組織特異性結構、與天然組織相同的機械強度等特征，并能提供微觀和宏觀的組織框架結構，利于細胞增殖分化，最終完成工程化的器官構建。本綜述主要對腎脫細胞支架的制作方法、脫細胞支架的質量評價、支架再細胞化、生物打印技術等做一總結，并探討腎脫細胞支架未來發展潛力及面臨的挑戰。

1 腎脫細胞支架的制作方法

1.1 腎脫細胞支架的動物選擇 人體腎是腎脫細胞支架理想來源[3]，其在組織工程學中的應用較其他物種來源的腎更具臨床相容性。Ross等[4]于2009年首次報道了以大鼠腎制作的脫細胞支架后，陸續有學者選用如豬[5]、猴[6]的腎，Orlando等[7]2013年首次選用廢棄的人類腎。考慮未來腎脫細胞支架成為標準品并規模量產的可能，因此脫細胞支架的動物來源必須充足并能持續供應，且未來若應用到人體則需體積更大的器官。豬具有繁殖力強、成長快、成熟期較短等優點并且豬源器官很容易獲得，因此豬成為最有價值的候選目標[8]。

1.2 脫細胞試劑的選擇 脫細胞的目的是去除組織中的細胞成分，保留微觀和宏觀結構以及功能性蛋白。灌注是制備全器官腎脫細胞支架最常用、最有效的途徑，使用血管作為灌注途徑將試劑送至器官各個角落，并可最大程度降低機械力作用導致的ECM損傷。制作腎脫細胞支架常用的試劑主要有化學試劑、酶類及其他生物制劑[9]，可根據實驗需求及試劑的特點，選擇合適的方法。

化學試劑：過氧乙酸[10]可水解器官中的生物分子，對ECM損傷較小；乙酸[11]對器官中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)影響較小，但能分解膠原從而影響支架的強度。堿類試劑能降低纖維基質或基質蛋白的交聯，從而影響支架的機械強度[11]。非離子表面活性劑如Triton X-100不帶電荷，對蛋白和膠原損傷較小；離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、脫氧膽酸鈉對細胞的洗脫更加徹底，但同時對支架的損傷也較大。

酶類試劑：蛋白酶、膠原酶以及核酸酶能裂解細胞膜、細胞與細胞、細胞與ECM或核酸與ECM間的黏附，但單獨使用不僅作用時間長且很難完全去除細胞，殘余的酶也會對支架的再細胞化產生影響。Yu等[12]發現小劑量酶類試劑聯合其他方法對腎的脫細胞效果良好。Crapo等[13]認為胰蛋白酶長時間作用可損傷ECM超微結構，同時消耗膠原蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和GAG。

其他生物試劑：螯合劑如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，可與Ca、Fe離子結合，有助于細胞從ECM中分離，單獨使用時不能去除組織細胞，但可破壞組織蛋白間的聯系，因此常與胰蛋白酶或表面活性劑聯合使用[14-15]。絲氨酸蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，以及抑肽酶和亮抑肽酶可阻斷脫細胞過程中由細胞裂解釋放蛋白酶對ECM造成的損傷[16]。抗生素如青鏈霉素、抗真菌藥兩性霉素B等常被用來減少脫細胞和再細胞化過程中的污染[17]。

1.3 常用腎脫細胞方法 脫細胞試劑的選擇主要取決于實驗目的以及試劑和組織的特點，實驗最終所需的組織復雜程度越高即要求保留的成分(如生長因子，宏觀、微觀結構等)越多，則脫細胞方案越復雜(表1)。目前尚無研究系統比較不同脫細胞試劑、暴露時間和不同的方法對DNA去除、ECM宏觀和微觀結構損失以及支架在體內的影響。腎脫細胞支架常用的制作方法主要有全器官灌注法和組織切片浸泡法。

全器官灌注法：完整的脈管系統和合適的去細胞化試劑，是灌注法制作腎脫細胞支架的關鍵[18]。Ross等[4]首先通過灌注3% Triton X-100，含0.002 5% DNA酶的高滲溶液后，再依次灌注3% Triton X-100和4% SDS進行腎的脫細胞化，結果表明小鼠腎ECM可保留層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，同時能支持小鼠胚胎干細胞向腎的分化。他們同時發現，使用脫氧膽酸鹽代替第二步后也能達到相同的結果。

組織切片浸泡法：將腎組織進行切片后再進行脫細胞處理，能增大組織和試劑的接觸面積，并能使機械力直接作用于組織，且DNA的去除和ECM成分的損失程度與脫細胞過程中攪拌速度有一定關系。Nakayama等[6]將恒河猴腎制成組織切片，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌腎切片兩次，然后用1% SDS或1% Triton X-100進行洗滌，8 h時首次更換脫細胞溶液，之后每48 h更換一次，直到組織透明(7 ～ 10 d)。

2 腎脫細胞支架的質量評價

脫細胞支架內的細胞殘余物在再細胞化的過程中可能會引起細胞相容性問題，且移植體內時存在不良宿主反應的風險[24]。目前脫細胞技術尚不能100%去除支架內所有細胞成分，但可定量測定細胞組分如雙鏈DNA(dsDNA)、線粒體或膜相關分子如磷脂，從而對脫細胞支架質量進行評價，并預估不良反應的風險[13]。

2.1 支架結構的完整性 腎脫細胞支架結構的完整性，是后續灌注及植入細胞的關鍵，包括宏觀和微觀結構的完整。前者可通過支架外觀、血管鑄型和血管網絡成像等方法判斷腎脫細胞支架結構是否完整[5,25]，后者可通過H&E染色、DAPI染色判斷。機械強度是另一個影響支架質量的因素，Mendoza-Novelo的研究[26]發現大多數表面活性劑會從支架中去除一些GAG，從而影響支架的機械強度；而且Conconi等[27]還發現隨著脫細胞試劑作用時間的延長，機械強度下降越明顯。因此根據不同的實驗需要探索合適的試劑及脫細胞時間極為重要[28]。

2.2 DNA含量測定 DNA與不良宿主反應直接相關，因此支架中定量檢測殘存的DNA極為關鍵，目前認為脫細胞化組織應具備以下特征[13]：1)H&E或DAPI染色未見細胞核；2)每毫克干重脫細胞支架含小于50 ng的DNA；3)DNA片段小于200 bp。DNA定量測量可通過市售試劑盒、碘化丙啶或雙苯甲亞胺以及凝膠電泳測得；也可將組織中加入蛋白酶K恒溫37℃約48 h，或利用組織試劑盒提取DNA并繪制標準曲線，最終使用分光光度儀進行定量測定[29]。

2.3 蛋白質定量分析 蛋白質定量分析有助于了解構成ECM的蛋白質種類及數量，以及可能發揮的作用。凝膠電泳和質譜分析是篩選組織或器官中蛋白質和多肽復雜環境的常用工具[30]，主要檢測的蛋白包括Ⅰ型、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等。熟知精確成分有助于研究人員建立仿生化的生物鏈，通過對ECM中的具體成分進行排列組合，可構建出適合細胞生長且免疫原性可控的支架。免疫熒光主要針對腎脫細胞支架中的Ⅰ型、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等水平以及vwf，CD31和α1鈉-鉀ATP酶等表達水平進行檢測[31]。羥脯氨酸檢測主要是定量測量總膠原，二甲基亞甲基藍檢測主要用來測量總硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan，sGAG)含量。

3 腎脫細胞支架再細胞化

對腎脫細胞支架進行再細胞化處理是生物人工腎構建過程中最復雜的階段。目前進行再細胞化的方法主要分為組織切片、灌注以及直接注射。組織貼片法主要用來研究脫細胞支架的成分對細胞功能的影響；灌注法是再細胞化技術重建功能性腎的最好方法；與灌注技術相比，直接將細胞注射入腎實質則能更好地控制細胞分布和再細胞化的區域。

細胞的來源對于重建具有功能的器官十分重要。目前較為理想的再細胞化的細胞類型主要有內皮細胞、上皮細胞、胚胎干細胞以及誘導多能干細胞。

內皮細胞和上皮細胞：內皮細胞是支架內血管通暢的前提，研究表明如果缺乏內皮細胞即使進行抗凝也會形成明顯的血栓[32]，因此支架在移植入體前必須實現再細胞化。Ko等[33]發現內皮細胞特異性抗體與血管壁結合，能促進內皮細胞的黏附。Song等[17]報道的大鼠腎全器官再細胞化的方法，主要通過大鼠腎動脈灌注人臍靜脈內皮細胞，同時從輸尿管灌注新生鼠腎細胞，借由此產生的壓力梯度使細胞充滿整個腎，培養4 d后細胞可遷移至合適位置，且發揮一定的功能。上皮細胞可來源于自體，也可選自其他物種。Abolbashari等[34]將分離的豬腎原代細胞，多次注射到豬腎脫細胞支架實質部分中，實現了細胞黏附和重建腎小管結構，但由于在支架表面形成了創傷，考慮到未來移植入體，故此法不適用于全器官的再細胞化。Caralt等[25]將人腎小管上皮細胞系注入大鼠腎動脈，并以高壓灌注促進細胞種植，結果表明高壓灌注能使細胞通過微循環穿過血管壁，從而達到細胞定植的效果。

表1 腎脫細胞常用的試劑及方法

胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)：Ross等[4]首次使用ESC進行腎脫細胞支架的再細胞化，他們通過腎動脈和輸尿管灌注入小鼠ESC，結果證實了小血管和腎小球的再生。Batchelder等[35]從猴腎脫細胞支架的腎動脈和輸尿管同時灌入人ESC，恒速灌注培養液并培養5 d后，在髓質的血管或管狀腔內發現了細胞。Remuzzi等[32]從腎靜脈和輸尿管逆行灌注細胞，同時外部給予負壓，發現只有少量細胞能夠到達皮質和髓質且分布不均勻，隨后他們優化了細胞種植的策略，加大灌注壓力及細胞數量，最終細胞分布情況較前明顯提高，但細胞在接種后7 d增殖顯著降低，因此仍需進一步探索更為有效的細胞種植方法。

人誘導多能干細胞：人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)是由體細胞中轉錄4種轉錄因子衍生而來的多能干細胞。Caralt等[25]將hiPSC衍生的內皮細胞通過腎動脈高壓注入脫細胞支架內，證實細胞能從血管中轉移至管周結構，并且在腎脫細胞支架內分布良好。Du等[36]將hiPSC衍生的PAX-2陽性腎祖細胞和內皮細胞同時注入小鼠腎脫細胞支架，隨后將支架植入SCID小鼠體內長達12周；他們還發現腎小球有一定的尿素和肌酐清除以及白蛋白重吸收的功能，表明內皮細胞與腎祖細胞共培養能促進支架的再細胞化。因此，即使hiPSC也存在畸胎瘤的風險，但其與ESC的相同分化潛力且無倫理爭議的優勢，使其有望成為未來種植細胞的熱門候選。

4 腎生物打印技術

腎再生目前存在的困難主要是如何提高脈管系統再細胞化的效率和選擇合適的種植細胞[37]，以及確定最佳接種細胞的方法。面對這些難題，科學家們將目光瞄向生物打印技術，希望能制造出具有高機械強度且生物相容性良好的人工腎[38]。Musah等[39]將hiPSC種植在生物打印的微流體片上，最終較為有效地將hiPSC誘導分化為足細胞，并發揮了一定功能，結果表明生物打印可以為細胞附著和分化提供材料支撐。但生物打印技術用于構建人工腎也面臨著諸多困難，如細胞活力是生物打印過程的關鍵參數，由于打印過程中的高應力可能會導致細胞凋亡[40]，而其原料不僅需要提供物理和機械支持，保證細胞存活，還應解決打印材料的批次變化或細胞和宿主對材料的不良反應等問題，因此尋找滿足上述要求的生物打印材料，應該是生物打印技術未來探求的方向。

5 結語

再生醫學的發展與進步為損傷修復及疾病治療提供了新選擇。在過去一段時間里，已報道較多關于脫細胞支架構建人工腎的研究。本綜述也總結了現階段腎脫細胞化支架和再細胞化的方法與研究進展。現有的脫細胞方案雖然能將絕大多數細胞(＞99%)洗脫干凈，但不可避免地損傷了支架ECM成分以及機械強度，未來應重點關注脫細胞過程中如何盡可能保留支架成分及性質。再細胞化的方案也需進一步優化。盡管目前誕生了幾種細胞種植的方法，也實現了細胞定植和功能發揮，但由于腎細胞種類和數量極多，只灌注一種或幾種細胞很難真正意義上實現腎再生。

腎器官再生工程仍處于早期階段。實驗室中雖已生產出動物的再細胞化人工腎，也幫助我們理解了腎細胞生物學，細胞分化和重塑，但距離應用于人體仍有巨大的差距，依然有許多困難和挑戰亟需解決，如怎樣利用腎脫細胞支架的特性消除遺傳以及其他因子的干擾，構建出可促進細胞生長分化的微環境等。而合適的滅菌方法、先進的生物反應器、甄選最佳種植細胞、合適的誘導細胞分化方法、實時定量評估脫細胞支架的質量、免疫原性和生物降解、評估重建器官的生長發育等方面則應是現階段需要關注的問題。