B細胞非霍奇金淋巴瘤組織中YAP1和P53的表達及意義

沈 艷，何新明，林喜娜，楊 通，陳貴東，古婉儀，顧 霞

1廣州醫科大學附屬第二醫院 病理科， 廣東廣州 511447；2廣州醫科大學附屬第一醫院 病理科，廣東廣州510120

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是一組來源于淋巴結或結外淋巴組織的惡性腫瘤，其發病率和病死率較高。NHL種類繁多，包括B細胞和T/NK細胞淋巴瘤兩大類、數十種類型，在臨床表現、形態學、免疫表型和遺傳學等方面具有高度異質性，目前其治療方法主要是化療，但部分患者療效不佳或不持久。近年來淋巴瘤治療的研究熱點集中在通過分子靶向來干擾關鍵信號轉導途徑，從而抑制腫瘤細胞的存活和增殖，以提高療效。Hippo通路是近年來發現的一條在生物進化上高度保守的細胞信號轉導通路，具有維持細胞增殖和凋亡平衡、調控器官體積等功能[1-4]。YAP1蛋白 (Yes-associated protein 1)是Hippo信號通路的核心效應因子，具有轉錄共激活因子活性[2]。研究發現Hippo-YAP1通路與P53蛋白存在交互作用[3]，該通路異常可導致人體多種疾病包括腫瘤的發生。目前，以Hippo-YAP1通路為靶點的治療策略為腫瘤治療提供了新思路[5-6]。雖然Hippo-YAP1通路在腫瘤中的研究已成為熱點，但迄今其在淋巴瘤方面的研究報道十分少見。本研究檢測了YAP1蛋白在B細胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin's lymphoma，B-NHL)中的表達，并分析其與p53蛋白表達的相關性，旨在進一步探討B-NHL發生的分子機制，為臨床診斷和治療提供新思路。

材料和方法

1 標本來源 收集廣州醫科大學附屬第一醫院病理科2012 - 2017年經病理檢查確診為的B-NHL的存檔標本60例，入選標本由兩名資深病理專家復讀切片，對其組織學類型進行回顧性分析并確診。診斷標準參照2016年版WHO關于淋巴組織腫瘤分類[7]。其中，男38例，女24例，年齡20 ～89歲，中位年齡63歲。另選取25例反應性增生淋巴組織(reactive hyperplasia of lymphoidtissue，RHL)標本作為對照組。

2 主要試劑 濃縮型鼠抗人單克隆抗體YAP1(克隆號：GT256)購自美國GeneTex公司，工作濃度按1∶800進行稀釋。即用型P53鼠抗人單克隆抗體為Dako公司產品，免疫組化GTVisionTMⅠ/HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自基因科技有限公司。

3 組織芯片的制作 在石蠟包埋標本的HE切片上選擇具有代表性的一個區域進行標記，用組織芯片儀在相應標本蠟塊(即供體蠟塊)上標記的相應部位打孔采集組織芯(直徑2 mm)，然后將組織芯轉移至另一個空白蠟塊(即受體蠟塊)相應孔位上，每個組織芯之間的間距為1.5 mm，制成陣列蠟塊。對陣列蠟塊進行4μm厚連續切片，再將切片轉移至載玻片上，即獲得組織芯片。

4 YAP1、P53蛋白檢測 采用免疫組織化學GTVision染色法：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min，加枸櫞酸，微波抗原修復，中火3 min×3次；自然冷卻至室溫；PBS液沖洗3 min×3次；3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性孵育10 min；PBS液沖洗3 min×3次；滴加一抗，其中YAP1抗體按1∶800進行稀釋，室溫箱孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次；滴二抗(GTVisionTMⅠ型聚合物)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每批染色均設陽性對照和陰性對照。以已知陽性反應片做陽性對照，以PBS替代一抗做陰性對照。

5 結果判斷YAP1表達 定位于細胞質和(或)細胞核，P53表達定位于細胞核，陽性細胞呈黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。YAP1采用半定量方法判斷結果：1)按細胞染色強弱評分：0分為不著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色；2)記取組織芯片中200個腫瘤細胞，陽性細胞所占百分比。計數陽性染色細胞占細胞總數的百分比：0分無陽性細胞；1分陽性細胞數＜10%；2分陽性細胞數10% ～ 50%；3分陽性細胞數＞50%。按以上兩項乘積判斷結果：0為陰性，1 ～ 2為(+)，3 ～ 4為(++)，＞4為(+++)。P53按陽性百分比分級：(-)無陽性腫瘤細胞或陽性腫瘤細胞＜30%；(+)陽性腫瘤細胞≥30%。

圖1 YAP1蛋白在各淋巴組織中的表達 A：DLBCL中呈強陽性表達，定位于胞質(IHC×200)； B：SLL中呈彌漫強陽性表達(IHC×100)； C：RHL中呈強陽性表達，陽性細胞彌漫分布于濾泡區和濾泡間區，其中濾泡生發中心表達強度最高(IHC×50)； D：RHL中局部(圖左側)可見成熟漿細胞富集(HE×200)； E：在成熟漿細胞中呈陰性表達，其周圍淋巴細胞呈陽性表達(IHC×200)； F：在DLBCL間質血管內皮呈陽性表達(IHC×50)Fig. 1 YAP1 expression in different lymphoid tissues A: High expression in DLBCL, and the cellular immunolocalization was cytoplasmic,IHC×200; B: Diffused strong positive expression in SLL, IHC×100; C: High expression in RHL, and the positive cells were distributed in the follicular and interfollicular regions, and the expression intensity of follicular germinal center was the highest, IHC×50;D: Mature plasmacytes enriched locally (left part) in RHL, HE×200; E: Negative expression in mature plasma cells and positive expression in peripheral lymphocytes, HE×200; F: Positive expression in the interstitial endothelium of DLBCL, IHC×50

6 統計學處理 實驗數據用SPSS17.0軟件進行處理，組間率的比較采用Fisher確切概率法，一致性分析采用Kappa檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 B-NHL類型與分組 60例B-NHL包括彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL) 49例，小淋巴細胞淋巴瘤(small lymphotic lymphoma，SLL) 7例，套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL) 4例。鑒于DLBCL生物學行為呈高侵襲性，而SLL和MCL為相對惰性，且病例數較少，為便于統計學分析，將后兩者合并為惰性組B-NHL。同時，按CD10、BCL-6和MUM1的表達將DLBCL分為生發中心B細胞型(germinal center B cell-like，GCB)和非生發中心B細胞型(non-germinal center B cell-likenon-GCB)兩個亞型，其中GCB型10例，non-GCB 39例。

2 YAP1在B-NHL和RHL中的表達 YAP1在B-NHL和RHL中的表達均定位于細胞質。其中在DLBCL中的表達陽性率為61.2%，在惰性組B-NHL和RHL中表達陽性率均為100%。YAP1在DLBCL表達的陽性率低于惰性組B-NHL和RHL (P＜0.05)。其中YAP1在GCB型和non-GCB型DLBCL的表達陽性率分別為60%(6/10)和61.5%(24/39)，兩組差異無統計學意義(P＞0.05)。在RHL中，YAP1在濾泡生發中心的染色強度高于濾泡套區和濾泡間區，雖然為彌漫表達模式，但在成熟漿細胞中未見表達。此外，YAP1在少數B-NHL血管內皮細胞的胞質中亦呈中-高強度陽性表達，而在RHL中血管內皮呈陰性或弱陽性表達。見表1，圖1。

3 P53在B-NHL和RHL中的表達 P53在B-NHL中的總體表達陽性率為16.7%(10/60)，其中在DLBCL中表達陽性率為18.4%(9/49)，在惰性組B-NHL中僅1例SLL呈陽性表達，陽性率為9.1%(1/11)，而在25例RHL中未見表達，陽性率為0。P53在DLBCL和惰性組B-NHL表達的陽性率高于RHL (P＜0.05)，但在DLBCL和惰性組B-NHL間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

4 YAP1、P53表達在B-NHL中的相關性 YAP1蛋白在P53蛋白陽性組與陰性組的表達率分別為60%(6/10)和70%(35/50)，兩組間YAP1蛋白表達率無統計學差異(P＞0.05)。在B-NHL中，YAP1蛋白表達與p53蛋白表達無顯著相關性(P＞0.05)。見表2。

表2 YAP1和P53在B-NHL中表達的相關性Tab. 2 Correlation between expression of YAP1 and P53 in B-NHL (n, %)

討 論

Hippo通路最早是由Edgar在果蠅(Drosophila)體內發現，對細胞增殖、分化和凋亡起著重要調控作用[8-9]。該通路在生物進化上高度保守，其在哺乳動物中信號傳遞順序則后來由Dong等[10]通過小鼠模型實驗首次確定。YAP1是Hippo信號通路下游的關鍵效應因子，具有轉錄共激活因子活性。通常情況下，磷酸化失活的YAP1定位在細胞質中，經去磷酸化后被活化，然后迅速由細胞質移至細胞核內，與轉錄因子結合從而激活靶基因的轉錄與表達[11-12]。Hippo-YAP1通路在機體多種生理病理過程中發揮重要的生物學功能，如調控器官大小、促進組織再生、維持干細胞自我更新等[13-14]。

近年研究發現，YAP1在卵巢癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、非小細胞肺癌等多種人類實體腫瘤中呈高表達，且與腫瘤的高侵襲性和不良預后有關[15-19]，提示YAP1在這些腫瘤發生發展過程中起著癌基因和抗凋亡作用。然而，最近對結直腸癌和乳腺癌等實體腫瘤的部分研究則得到相反的結論，認為YAP1可能作為一種抑癌基因參與了這些腫瘤的發生[20-21]。雖然，活化的YAP1通常情況下富集在細胞核內發揮作用，但新近研究表明，胞質定位的YAP1可通過促進β-catenin降解、抑制Wnt信號通路等方式起到腫瘤抑制因子作用[22]。綜上，目前學者們認為YAP1在人類惡性腫瘤中扮演著原癌基因或抑癌基因的雙重角色，究竟以何角色發揮作用，則與起源細胞/組織/器官種類、腫瘤類型、YAP1的亞細胞定位、信號通路交互方式等因素有關。

表1 YAP1、P53在B-NHL和RHL中的表達Tab. 1 Positive expression of YAP1 and P53 in B-NHL and RHL (n, %)

雖然YAP1已成為近年來腫瘤的研究熱點，但迄今鮮見有關其在淋巴瘤方面的研究報道。本研究結果顯示YAP1在良性反應性淋巴組織中廣泛表達，陽性細胞為彌漫分布于淋巴濾泡、濾泡間區的各階段淋巴細胞，其中以濾泡生發中心表達強度最高，但在成熟漿細胞中呈陰性表達，提示YAP1在成熟B細胞分化過程中發揮作用，具體機制尚待進一步研究。在B-NHL中，YAP1在生物學行為相對惰性的SLL和MCL亞型中的表達情況，與在良性反應性淋巴組織中的表達相似，均呈中-強度彌漫表達；而在侵襲性較高的DLBCL亞型中，38.8%的病例YAP1蛋白缺失、呈陰性表達。由于淋巴細胞在成熟過程中要經歷很多階段，而淋巴瘤在許多方面重復著正常淋巴細胞的分化階段，因而淋巴瘤分類在一定程度上反映了對應的正常分化階段的形態、遺傳學特征和免疫表型[7]；鑒于此，結合本研究中YAP1在RHL和B-NHL中表達的特點，進一步表明YAP1在處女B細胞至漿細胞前的各分化階段(即處女B細胞→生發中心B細胞→記憶B細胞)中發揮重要作用。此外，由于YAP1在RHL的生發中心B細胞中呈強陽性表達，但在對應生發中心B細胞起源的一些DLBCL中呈陰性表達，提示YAP1可能作為腫瘤抑制基因參與了部分DLBCL的發生發展。

p53基因定位于人類染色體的17p13.1，是重要的腫瘤抑制基因。該基因的突變或失活是多種腫瘤發生發展過程中的重要因素。迄今已證實至少50%的實體性腫瘤存在p53基因的缺失或突變。雖然在血液病和淋巴瘤中，p53缺失和突變的頻率沒有其他腫瘤高，但它與淋巴瘤發生、進展、化療耐藥等密切相關，并且可能是侵襲性淋巴瘤的預后不良因子[23-24]。新近研究發現，p53與Hippo-YAP1通路之間存在交互作用，p53基因狀態可影響Hippo-YAP1通路的促癌或抑癌效應的轉化。野生型P53蛋白能夠與YAP1啟動子結合從而激活YAP1轉錄，而YAP1蛋白作為轉錄共激活因子，又能促進p53基因轉錄，兩者相互作用形成正反饋調控環，參與誘導細胞凋亡和抑制腫瘤形成[25]。突變型P53蛋白則能夠與YAP1直接結合形成YAP1/突變型P53蛋白復合體，進而與轉錄因子NF-Y結合形成一個多蛋白復合體，該復合體能夠與CCNA、CCNB和CDK1等基因的調控區相結合而增強基因轉錄、促進細胞增生和腫瘤形成[26-27]。本研究結果顯示，突變型P53蛋白在B-NHL表達的陽性率為16.7%，其中在DLBCL陽性率為18.4%，與文獻報道相似[28]。雖然突變型P53蛋白在B-NHL中表達陽性率不高，但分析結果顯示它在B-NHL和RHL間表達有顯著差異，推測它可能在少數B-NHL中起到了促進作用。另外，本研究數據未發現突變型P53蛋白表達與YAP1蛋白表達之間存在顯著相關性，表明突變型P53蛋白和YAP1可能通過不同的途徑和機制參與了部分B-NHL的發生發展。

綜上，本研究顯示B-NHL中存在Hippo通路的異常，YAP1蛋白可能作為腫瘤抑制因子參與了部分B-NHL的發生發展，但與突變型P53蛋白的表達無相關性，其具體作用機制尚有待從分子水平進一步闡明。