2 466例高危型人乳頭瘤病毒亞型的感染和分布研究

楊紫汐，龍文波，陳 明，劉 云，劉 潔，張原雪，孫興旺△

(1.西南醫科大學附屬醫院病理科，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學臨床醫學院病理教研室，四川瀘州 646000)

人乳頭瘤病毒(HPV)分為低危型(LR-HPV)和高危型(HR-HPV)兩類，前者主要引起低級別上皮內病變，后者不僅能引起高級別病變，同時有導致癌變的風險[1-2]。HR-HPV具有基因型的差異，在致癌能力和致病形式上存在許多區別[3]。研究HR-HPV基因型的分布特點，有助于優化利用地區醫療資源，開發更經濟高效的防治手段。

本研究采用2 466例女性宮頸脫落細胞DNA樣本，采用熒光定量PCR技術對13種HR-HPV基因型進行檢測，并研究HPV的病毒載量與上皮內病變程度的相關性，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本來源為2014-2017年在西南醫科大學附屬醫院就診的女性患者。從樣本庫中總計獲得2 466個患者宮頸脫落細胞的DNA樣本。患者年齡16～77歲，平均(39.7±9.4)歲，均先進行液基細胞學檢查(TCT)。組織病理學檢查確定有病變或可疑樣本的病變情況(合計1 469例)。本研究的體外試驗程序通過西南醫科大學附屬醫院倫理審查委員會審核批準，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量PCR檢測 脫落細胞懸液樣本試管加入1.0 mL無菌水，震蕩混勻，吸取適量液體轉移至1.5 mL離心管，之后離心收集細胞和組織。DNA提取和定量PCR檢測13種HR-HPV基因型(HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68)按照上海之江生物科技股份有限公司的HR-HPV分型核酸測定試劑盒方法進行。定量PCR檢測的內參基因為人類基因組進化上保守的雙底物特異性酪氨酸磷酸化調節激酶a(DYRK1a)。

1.2.2 宮頸病變診斷 TCT細胞學檢查按照2001年國際病理學會修訂的TBS系統診斷標準進行：未見上皮內病變或惡性細胞(NILM)，包括正常和炎癥組織；能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞/含不能排除高級別病變(ASC-US/H)；低級別鱗狀上皮病變(LSIL)；高級別鱗狀上皮病變(HSIL)；鱗狀細胞癌(SCC)；不典型腺細胞(AGO)和宮頸腺癌(ECA)。對檢測到上皮內病變或惡性細胞的病例進行的病理學檢查，按照2014年WHO(第4版)標準分類：(1)炎癥和良性病變：包括宮頸炎、宮頸納氏囊腫、宮頸肥大、觸血、糜爛、尖銳濕疚、息肉等；(2)宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ：輕度CIN，相當于LSIL；(3)CINⅡ和CINⅢ：分別為中度和重度CIN，相當于HSIL，其中CINⅢ包含原位癌；(4)宮頸癌：浸潤性宮頸癌；(5)其他為術后復查病例等。

1.2.3 相關性分析賦值 相關性分析中定義上皮內病變CINⅠ至CINⅢ按惡性程度分別對應分值為1～3分，宮頸癌對應分值為4分，正常宮頸、炎癥和良性病變及其他組對應分值為0分。HPV病毒的DNA載量計算公式：DNA載量=2內參CT值-HPV擴增CT值，CT值即PCR擴增的循環閾值。

1.3 統計學處理 采用SPSS22.0軟件處理統計結果，計數資料用率表示，組間采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關檢驗。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸病變分布 細胞學檢查為LSIL的樣本97個，經組織病理學診斷為CINⅠ的有70個(72.16%)；細胞學檢查為HSIL的樣本136個，經組織病理學診斷為CINⅡ～Ⅲ的有112個(82.35%)；細胞學查見癌細胞的樣本37個，經組織病理學診斷為浸潤性宮頸癌的有30個，符合率81.08%；細胞學檢查為ASC-US/H的樣本38個，經組織病理學診斷符合良性和炎癥病變的21個(55.26%)，符合CINⅠ的有16個(42.11%)，符合CINⅡ～Ⅲ的1個(2.63%)。組織病理學檢查發現存在炎癥、良性病變和惡性病變的樣本合計1 469個，其分布為：炎癥和良性病變(1 064/1 469，72.43%)，CINⅠ(99/1 469，6.74%)，CINⅡ～Ⅲ(132/1 469，8.99%)，宮頸癌(33/1 469，2.25%)及其他(141/1 469，9.60%)，見表1。在>30～40年齡組中，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌患者的分布比較差異無統計學意義(P=0.074)，但是CINⅠ和CINⅡ～Ⅲ的比例隨著年齡增長有所增加(P<0.05)。宮頸癌的病例超過80%出現在大于40年齡組中，且隨年齡增大比例增加，見表2。

表1 2 466例樣本的HPV感染情況

2.2 HR-HPV基因型的分布 在2 466個樣本中，總計檢測到575個(23.32%)HR-HPV感染樣本，其中468個(81.39%)為單基因型感染，90個(15.65%)為雙基因感染，14個(2.43%)為3基因型感染，還有3個(0.52%)為4基因型感染(表3)。在50歲以下的患者中，HR-HPV的感染率接近，在16～30、>30～40和>40～50組中分別為23.19%(109/470)、23.66%(176/744)和21.38%(217/1 015)。但在大于50歲患者中，HR-HPV的感染率明顯提高，在>50～60和>60組中分別達到29.63%(56/189)和35.42%(17/48)。

表2 不同年齡段患者宮頸的上皮內病變情況[n(%)]

表3 HPV感染的基因型數目分布情況[n(%)]

HPV不同基因型中，感染頻率最高的是HPV-52，總共在154個(26.78%)HR-HPV感染樣本中檢測到，其余基因型依次為HPV-16(24.87%)、HPV-58(20.52%)、HPV-51(9.22%)、HPV-39(8.35%)、HPV-33(5.74%)、HPV-56(5.57%)、HPV-35(4.70%)、HPV-31(4.00%)、HPV-18(4.00%)、HPV-59(3.83%)、HPV-68(2.96%)和HPV-45(1.57%)。HPV-52、HPV-16和HPV-58是HPV感染的主要類型，三者在HR-HPV感染樣本中所占比例合計達72.17%。但是，盡管HPV-52總感染率最高，在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中，HPV-16(25.00%、57.58%)和HPV-58(16.67%、12.12%)的比例卻超過HPV-52(11.36%、3.03%)。此外，HPV-33在CINⅡ～Ⅲ樣本中也有較高比例(11.36%)。除HPV-52、HPV-16和HPV-58外，HPV-51、HPV-39、HPV-33和HPV-56的在HR-HPV感染樣本中的比例均超過5.00%，合計共28.88%。各基因型在不同病癥的分布見圖1。

圖1 2 466個樣本的HPV基因型按照病癥表現分布

HPV基因型與年齡的相關關系相關系數P與宮頸上皮病變程度的相關關系相關系數P160.1560.0670.2030.015180.4440.0390.1970.38031-0.0540.8050.0610.782330.1060.5580.1150.523350.0600.771-0.2040.31939-0.0010.993-0.1040.48645-0.4770.232-0.1900.624510.1040.4610.0450.74752-0.2100.802-0.1900.81556-0.0060.9760.0990.60258-0.1830.0510.3090.00159-0.0470.846-0.0750.75568-0.4460.110-0.1980.498合計-0.0090.8120.209<0.01

2.3 HPV的DNA載量與上皮內病變程度的相關性分析 HPV病毒的DNA載量與上皮內病變程度呈正相關(P<0.01)，而與患者年齡沒有明顯相關性(P=0.812)。HPV-16和HPV-58的DNA載量與上皮內病變程度呈明顯正相關(P<0.05)，HPV-18與年齡呈正相關(P=0.039)，見表4。

3 討 論

HPV感染是宮頸癌的關鍵誘發因素。本研究分析了川南地區HR-HPV感染的分布特點，發現2 246例患者樣本中HR-HPV的總感染率為23.32%，接近中國地區大樣本研究結果[4]。其中宮頸癌樣本HR-HPV的檢出率為81.82%，符合其他不同地區研究報道的80%～96%的感染率[1,5]。

世界范圍內HR-HPV基因型的分布具有地域特點，但在總體上以HPV-16和HPV-18感染率最高[1,5]。而本研究感染率最高的5個基因型為HPV-52、HPV-16、HPV-58、HPV-51和HPV-39，而HPV-18較低。這可能是因為HPV-18主要出現在腺癌[6]，本地區的宮頸癌樣本基本都是鱗癌所致。HPV-52和HPV-58的感染率極高，在2 466個樣本中分別占第1和第3位，表明在亞洲東部這兩種基因型可能具有很強的導致上皮病變能力[7-9]。然而，在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中，HPV-16的感染率最高遠超過其他基因型，表明HPV-16是最能引起惡性上皮內瘤變的基因類別[10]。值得注意的是，HPV-58在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中的感染率僅次于HPV-16，提示在川南地區HPV-58可能是也是極具危害性的基因類型。

目前學界已經知道，HPV的持續感染是宮頸癌發生的主要因素之一。HPV感染常無臨床癥狀，感染平均持續時間8～12個月，高危型的平均清除時間為8～14個月，但是HPV-16和HPV-18持續感染的時間更長[11]。2015年美國陰道鏡和宮頸病理學會和婦科腫瘤協會臨床指導指出：如果HPV-16和HPV-18陽性，無論TCT結果如何都建議進行陰道鏡檢查；如果其他HR-HPV陽性，細胞學無異常，建議1年內隨訪[12]。本研究提示HPV-58在川南地區具有極強的致高級別上皮內瘤變和宮頸癌能力，危害性僅次于HPV-16，高于本研究其余的HR-HPV基因型。因此，對川南地區的HPV-58陽性患者，即使其細胞學無異常，可能也有必要進一步進行組織學檢查或進行更密切的臨床隨訪。

目前研究表明，HR-HPV病毒的DNA載量與宮頸病變存在明顯正相關關系，可能作為預測宮頸病變程度的生物學標記[13-15]。本研究發現HPV病毒的DNA載量與上皮內病變程度呈明顯正相關(P<0.01)，與該觀點一致。大量的病毒DNA感染導致機體清除機制更難發揮作用，因而長期持續感染某一亞型更容易導致宮頸癌發生[16-18]。然而，本研究HR-HPV的13種基因型中，僅有HPV-16和HPV-58的DNA載量與上皮內病變程度呈明顯正相關，其余基因型均無明顯相關性。提示HPV-16和HPV-58型致宮頸上皮病變可能具有不同于其余亞型的作用機制，其DNA載量有可能作為檢測的生物學標記，但這一點還需更多研究加以證明。