重癥甲型H1N1流感患者核酸檢測和特異性抗體檢測的診斷價值分析

張群 劉超 李蕾

【摘 要】 目的：探討重癥甲型H1N1流感患者中流感病毒核酸檢測和特異性抗體檢測的診斷價值。方法：2016年3月～2018年4月 期間流感實驗室收集的40例重癥甲型H1N1流感病例血清和鼻咽拭子標本，并采用血凝抑制法和巢式RT-PCR對患者血清中特異抗體及鼻咽拭子中流感病毒RNA進行檢測。結果：急性期和恢復期血清效價比較，抗體差異顯著。25%患者兩種方法檢測均表現為陽性，45%患者兩種檢測方法均表現為單獨抗-甲型H1N1陽性，30%患者均表現為單獨甲型H1N1RNA陽性；甲型H1N1流感病例血清中特異性抗體，發病時間越長陽性檢出率越高，差異具有統計學意義（P<0.05）；核酸檢測結果顯示，在發病早期更容易檢出流感病毒的RNA，差異明顯。結論：核酸檢測與特異性抗體檢測結合使用有助于提高流感病例檢測準確性，提高治療效果。

【關鍵詞】 甲型H1N1流感；流感病毒；特異性抗體；RNA；診斷價值

【中圖分類號】 R365 【文獻標志碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）17-044-02

一般流感病毒不同，甲型H1N1流感經禽流感、豬流感、人流感三種病毒重組，屬于新型的流感病毒[1]。本文旨在探討重癥甲型H1N1流感患者中甲型H1N1流感病毒RNA和特異性抗體的診斷價值，收集40例重癥甲型H1N1流感病毒患者為研究對象，現報告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月～2018年4月期間流感參比實驗室收集的40例甲型H1N1流感病例，所有病例均符合《甲型 H1N1流感診療方案》診斷標準，男25例，女15例，年齡15～76歲，平均年齡（45.5±4.2）歲，其中14例病例伴隨著基礎疾病，4例病例為孕產婦。

1.2 檢測方法 使用生理鹽水對鼻咽拭子進行稀釋，再吸取0.5ml放置在無菌管中，保存在-20℃環境中，如有使用需求，需提前30分鐘標本放入95℃水中進行滅活，才能提取RNA。靜脈血液樣本離心2小時內，必須進行血清分離，保存在4℃環境中，并在一周內檢測甲型 H1N1流感特異性抗體。檢測試劑選用Promgeag公司的AMV Erverse Transcriptase，TaKaRa 寶生物工程（大連）公司的Dntp和Ex Taq DNA聚合酶，上海生物工程有限公司的總RNA提取試劑盒，Sigma公司的受體破壞酶以及長春生物制品研究所的甲型 H1N1流感標準抗原。采用巢式RT-PCR技術對鼻咽拭子樣本進行檢驗，通過A型流感通用物MP1、MP2、ANP1、ANP2及甲型H1N1流感特異性鑒定引物 H1HAP1、H1HAP2鑒定PCR擴增。采取血凝抑制法對血清樣本進行檢驗，使用受體酶按4：1比例加入血清中，將血清樣本水浴（37℃）14小時，再放置滅活（56℃）30分鐘，配置4個紅細胞凝集單位/25ul抗原，將微量板中加入PBS，每個孔25ul，在第一例微量板中加入處理好的血清25ul，按照倍比稀釋依次進行添加，最后一個孔空留，加入4個紅細胞凝集單位/25ul抗原，并在溫室放置20分鐘進行孵育，每個孔加入新鮮雞蛋紅細胞懸液（0.75%），再孵育30分鐘后觀察結果。

1.3 結果判定 甲型H1N1 RNA陽性病例對最后1次陽性進行統計，抗-甲型H1N1陽性病例對最早1次陽性進行統計。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0軟件對本次研究數據做統計學分析，以均數±標準差（x±s）表示計量資料；以百分比表示計數資料，P<0.05時提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲型H1N1流感病毒病例血清檢測結果 40例甲型H1N1流感病毒血清樣品檢測表明，所有抗體>1：320，抗體有效價>1：5120樣品19份，特異性抗體陽性，28例，陽性檢出率70.00%，急性期和恢復期血清效價比較，抗體差異顯著。25%病例兩種方法檢測均表現為陽性，45%病例兩種檢測方法均表現為單獨抗 -甲型H1N1陽性，30%病例均表現為單獨甲型H1N1RNA陽性。

2.2 不同時間陽性檢出率分析 甲型H1N1流感病例血清中特異性抗體，發病時間越長陽性檢出率越高，差異具有統計學意義（P<0.05）；核酸檢測結果顯示，在發病早期更容易檢出流感病毒的RNA，差異明顯，詳見表1.

3 討論

甲型H1N1流感屬于急性呼吸道疾病，主要由甲型H1N1流感病毒所致，好發于青少年群體[2]。該疾病具有一定的傳染性，且潛伏期較長，主要通過飛沫、體液、分泌物、鼻腔、口腔、眼睛黏膜直接或間接傳播。發病后病例出現發熱、咽喉疼痛、渾身乏力、酸痛、惡心、嘔吐、腹瀉、咳嗽咳痰等臨床癥狀，嚴重者甚至引起肺炎、肺出血、呼吸窘迫綜合征、腎功能衰竭等并發癥[3]。由于甲型H1N1流感病毒中NP蛋白和M蛋白含量較高，且保守性好，因此，甲型H1N1流感檢查時可作為通用引物進行鑒定。而血凝素HA變異性較高，可作為特異性鑒定引物。國外相關資料研究結果表明[4]，HIV感染會破壞患者自身免疫系統，繼而感染甲型 H1N1流感病毒，感染7天后對患者采取RT-PCR檢測發現，陽性率為29%，且患者體內血清特異性抗體滴度均處于低下水平。如患者在14～30天后RT-PCR檢測血清特異性抗體滴度仍處于低下水平時，可能與患者基礎疾病所服免疫抑制藥物有關。因此，在甲型 H1N1流感診斷過程中，如患者自身免疫力較低，應將隔離期限適當延長，直至核酸檢測表現為陰性時方可解除隔離，以免造成疾病傳播。

為提高甲型 H1N1流感病毒檢驗準確率，可將核酸檢測和血清傳播結合使用，前期采取核酸檢測，后期采取血清檢測，這種有助于提高臨床檢驗準確性，提高治療效果。

參考文獻

[1] 李玉香，汪楊，鮑萬國等.重癥甲型 H1N1流感病毒基因與特異性抗體檢測的診斷意義[J].中華醫院感染學雜志，2016，（12）：2641-2643.

[2] 李玉香，汪楊，高玉偉等.甲型H1N1流感病毒流行病學調查[J].中國免疫學雜志，2016，（8）：1098-1100.

[3] 白志軍，吳新偉，伍業建等.廣州地區新型甲型H1N1流感患者病毒RNA檢出率與病程關系的研究[J].南方醫科大學學報，2017，29（11）：2313-2315.

[4] 王文靜，何菡，趙秀英等.甲型H1N1流感患者血液與尿液樣本病毒核酸檢測與分析[J].中華醫院感染學雜志，2016，20（6）：805-806.