以堿性聚合酶2(PB2)為靶點的抗流感病毒藥物的虛擬篩選

王 強，石 橋，劉 金

(中南民族大學 藥學院，武漢 430074)

流感病毒可分為A,B,C三型，A型流感能頻繁引起全國性和季節(jié)性流感，豬類和禽類都可以作為A型流感的宿主；B型流感能引起流行性感冒甚至可導致人類死亡，尤其是兒童[1-3].美國抗流感病毒藥物的現(xiàn)行標準是神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAIs)奧司他韋和扎那米韋，這些藥物對于A型和B性流感有效，但神經(jīng)氨酸酶抑制劑對于嚴重病癥效果輕微，必須在感染的24～48 h內(nèi)攝入[4]，且易產(chǎn)生耐藥性[5]，尤其是H5N1流感已經(jīng)表現(xiàn)出了對奧司他韋的耐藥性[6].

流感病毒基因組含有8個RNA片段，可編碼11種病毒蛋白質(zhì)，由PA,PB1和PB2這3個亞基組成的聚合酶復合體是病毒基因組RNA復制和mRNA轉(zhuǎn)錄的關鍵組分，由于它突變率低、高度保守，成為抗流感病毒藥物設計的重要靶點.在宿主細胞核中，這種聚合酶通過一種稱為“cap-snatching”的方式來轉(zhuǎn)錄vRNA[7].在轉(zhuǎn)錄過程中，PB2的帽結合區(qū)域結合到宿主前信使5′端帽子結構上[8]，帽子和帽子下游的10～13核苷酸被聚酰胺的N端核酸內(nèi)切酶區(qū)域分開，隨后產(chǎn)生的5′帽子RNA片段被PB1亞基用作合成的病毒mRNA的引物[9, 10]. PB2通過影響“cap-snatching”的轉(zhuǎn)錄過程對病毒復制十分重要，對帽結合、核酸內(nèi)切酶或聚合酶的抑制劑，都是抗病毒治療的潛在手段，成為積極研發(fā)的作用靶點[11, 12].

PB2成為抗病毒治療的靶點不久后，Michael P. Clark以環(huán)烷基并哌啶基氯氮雜吲哚為母核進行優(yōu)化，得到化合物VRT-0761704，m7GTP和VRT-0761704與PB2的帽結合區(qū)域結合的X光晶體結構被成功確認[3].盡管分屬于不同空間的PB2帽結合部分,但與之前m7GTP 的結果一致[13]，結構揭示VRT-0761704占據(jù)了m7GTP的結合區(qū)域并產(chǎn)生同m7GTP鳥嘌呤相似的與蛋白質(zhì)之間的連接.Michael P.Clark的實驗顯示m7GTP和VRT-0761704均與側(cè)鏈GLU361和LYS376形成氫鍵.VRT-0761704的氮雜吲哚部分被夾在芳香性側(cè)鏈HIS357和PHE404，嘧啶環(huán)上的大π鍵與PHE323排斥.VRT-0761704的二甲基丙酰胺位m7GTP的核糖和α-磷酸鹽附近.同時，他們還發(fā)現(xiàn)化合物VX-787也在體外表型細胞保護試驗中對大多數(shù)A型流感表現(xiàn)出強力的抗病毒活性——包括對神經(jīng)氨酸酶抑制劑和金剛烷胺有耐藥性的流行性流感H1N1和H5N1，并且活性只針對A型流感，對B型流感只有微弱的作用[14](見圖1).

SPECS數(shù)據(jù)庫(www.specs.net)由荷蘭SPECS公司于1987年開發(fā)，其中所有化合物均可在SPECS公司購買，數(shù)據(jù)庫會根據(jù)各個化合物的庫存量定期更新.為了使篩選的結果更加準確可靠，防止漏篩，本研究針對已報道的兩種大分子結構相同但結合小分子不同的晶體結構，以PB2為靶點，使用分子對接技術篩選數(shù)據(jù)庫中潛在的抑制劑，發(fā)現(xiàn)2個高活性的PB2抑制劑，探討了抑制劑與PB2之間的結合模式，對以PB2為靶點的抗病毒藥物研究有重要意義.

圖1 堿性聚合酶2抑制劑Fig.1 PB2 inhibitors

1 實驗方法

1.1 配體小分子的準備

利用SPECS數(shù)據(jù)庫(www.specs.net)設定：1)化合物的分子量不大于550；2)化合物結構中的氫鍵供體(包括羥基、氨基等)的數(shù)量不大于5個；3)化合物中氫鍵受體的數(shù)量不大于10個；4)化合物的脂水分配系數(shù)的對數(shù)值(logP)不大于5；5)必須含有1個以上芳環(huán)結構.初篩找出282717個化合物的3維數(shù)據(jù)建成數(shù)據(jù)庫，所有分子構建和對接計算模塊均在方正文祥E520計算機上，使用SYBYL軟件包完成，計算中使用的各項參數(shù)除非特別說明均采用缺省值.

1.2 流感病毒PB2亞基結構準備

從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中搜索到流感病毒PB2的2種晶型[3]：4NCM和4P1U，下載它們的三維數(shù)據(jù)，保存為4NCM.pdb和4P1U.pdb.使用sybyl軟件對流感病毒PB2蛋白晶體結構進行預處理，去掉邊緣的水分子，加上氫原子，對蛋白質(zhì)分子加載AMBER7 FF99電荷，并對原有小分子抑制劑加載Gasteiger-Hückel電荷，其中電荷類型與預處理一致.在晶體結構中提取原有小分子抑制劑的結構，用來確定對接位點.

1.3 配體小分子的虛擬篩選和分子對接

將數(shù)據(jù)庫中的化合物分子作為配體，使用SYBYL SurFlex模塊與PB2晶體結構進行對接，選擇對接區(qū)域模式為ligand，以上文中提取出的4CNM-ligand.mol2為引導文件.點選generate生成探針文件，確定jobname為4NCM開始分子對接，將對接結果之一的打分圖保存，并將打分靠前的3個化合物與4NCM結合的文件用Discovery Studio 4.1 Client打開，標示出活性位點的空間構象，受體與供體的連接作用方式，截圖保存.

2 結果與討論

2.1 配體小分子虛擬篩選結果

配體小分子虛擬篩選結果見圖2.

2.2 分子對接分析

配體小分子AO-022/43453673與4NCM的對接結果見圖3.由圖3可見，該化合物分子內(nèi)形成氫鍵，用于穩(wěn)定分子構型.分子中苯環(huán)上的甲氧基與SER321上的羥基形成氫鍵，胍基上的氫與GLU361的氧形成氫鍵，嘧啶環(huán)與LYS376形成氫鍵.嘧啶環(huán)上的羥基同時與LYS376和PHE404形成氫鍵.此外，分子中的嘧啶環(huán)還與HIS357和PHE404存在π-π相互作用，苯環(huán)與PHE325存在π-π相互作用，進一步增加了小分子與蛋白質(zhì)結合的穩(wěn)定性.

圖2 對接結果Fig.2 Docking results

配體小分子AN-655/14860175與4NCM的對接結果見圖4.由圖4可見，配體小分子與蛋白質(zhì)晶體形成氫鍵而牢固地固定在腔體中，分子中的甲氧基與ASN429的氨基形成氫鍵.除氫鍵外，分子中的苯環(huán)、咪唑、四氫咪唑環(huán)與HIS357,PHE323和PH404中存在π-π相互作用，極大地增強了小分子的活性.此外，分子還與HIS357,PHE323和PHE404存在疏水作用力.

圖3 配體小分子AO-022/43453673與4NCM的對接結果Fig.3 Docking result of small ligand molecule AO-022/43453673 and 4NCM

圖4 配體小分子AN-655/14860175與4NCM的對接結果Fig.4 Docking result of small ligand molecule AN-655/14860175 and 4NCM

3 結語

結合本文虛擬分子對接實驗結果與Michael P. Clark研究發(fā)現(xiàn)的化合物VX-787的結合情況可知：對接結果較好的小分子化合物的共同特征是含有多羥基和羰基，能與活性中心的多處氨基酸殘基形成氫鍵，分子中的芳環(huán)或芳雜環(huán)多能與HIS357, PHE404, PHE323之間存在π-π相互作用，并被活性位點附近殘基組成的疏水口袋包圍，使化合物分子與活性中心結合更加緊密，抑制作用更強.側(cè)鏈引入苯環(huán)等疏水基團能與活性中心的氨基酸殘基形成較強的疏水作用力，這是化合物產(chǎn)生作用的關鍵.Zincs數(shù)據(jù)庫編號為AO-022/43453673，AN-655/14860175等打分排名靠前的化合物均具備潛在的治療流感病毒的能力，可作為抗流感病毒新藥的小分子.