茶樹N-甲基轉移酶基因啟動子克隆及功能分析

劉平，任秋婧，康馨，張媛媛，林曉蓉，李斌，高雄，陳忠正

華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642

茶是世界三大無酒精飲料之一，含有茶多酚、生物堿、維生素、氨基酸、礦物質、茶多糖、有機酸等700多種藥理活性物質及營養成分?？Х葔A是茶葉的主要生物堿，約占干物質含量的2%～4%，具提神醒腦、促消化、強心、解熱鎮痛等功效[1-2]。已有研究表明，植物體內咖啡堿生物合成的核心途徑為：黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿→咖啡堿，N-甲基轉移酶（NMT）是催化其3步轉甲基化反應合成咖啡堿的關鍵酶[3]。NMT基因的克隆始于Moisyadi等[4]對咖啡植物的報道，其克隆到的黃嘌呤核苷N-甲基轉移酶基因具有催化咖啡堿合成第一步轉甲基化反應的功能。茶葉中NMT基因的克隆最早由Kato等[5]在2000年報道，其克隆到的TCS1（AB031280）具有后兩步轉甲基化反應的功能。其后國內外研究者包括本課題組相繼在茶葉、咖啡、可可等植物中克隆出多個具不同催化功能的NMT[6-8]，從基因角度證明 NMT基因具有家族性，咖啡堿/可可堿的合成是在多個NMT基因的作用下合成。

啟動子是啟動功能基因轉錄的重要部件，也是靶基因調控中轉錄調控因子結合并實施調控的重要元件，很多重要功能基因的啟動子包括水稻、擬南芥等植物已進行了大量研究[9-11]。NMT作為咖啡堿合成的關鍵酶，已有報道多集中于NMT基因尤其cDNA的克隆，基因啟動子的研究報道較少。2005年，Satyanarayana等[12]用PCR技術從咖啡植物中分離出NMT基因的啟動子，并通過轉基因技術在煙草中測定了克隆啟動子的功能。茶樹作為含咖啡堿植物，雖然在咖啡堿合成的NMT基因啟動子研究方面有報道，但均停留在啟動子序列分離階段[7,13]，尚未見對其功能研究的報道。本課題組前期在克隆茶葉NMT基因的過程中，從英紅9號茶樹 cDNA文庫篩選獲得多個高度同源但具不同催化功能的NMT基因[8]，其中命名為NMT1的基因功能非常類似報道的TCS1，并發現僅NMT1基因會與同材料中克隆的其他NMT基因存在蛋白互作，基因表現非常特殊[14]。因此，本研究在克隆NMT系列基因基礎上，利用 hiTAIL-PCR法從英紅 9號茶樹克隆YH-NMT1基因啟動子，通過生物信息學分析其順式作用元件，借助轉基因技術研究該啟動子的功能特性及環境脅迫對其功能的影響。研究的開展將為了解 NMT1基因啟動子在植物發育過程中的表達模式提供實驗依據，并為研究NMT基因轉錄調控及培育特定咖啡堿含量茶樹提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

英紅9號春季一芽二葉嫩梢，采于華南農業大學園藝學院實驗教學基地，液氮冷凍后-80℃保存備用；煙草組培苗、大腸桿菌DH5α、農桿菌菌株 GV3101和植物雙元表達載體pBI121由本實驗室保存；T4DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、XbaI、Hind III限制性內切酶、DNA marker購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物合成和DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設備

5804R高速離心機、Mastercyler pros基因擴增儀（德國Eppendorf公司），U410-86超低溫冰箱（美國NBS公司），GHP-9080培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），MK20E恒溫金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司），分析天平（Mettler Toledo公司），Milli-Q Integral 3純水系統（美國 Milli-pore公司），XB-40制冰機（美國Grant公司），Bio-rad電泳儀、Gel doc XR+成像儀（美國 Bio-rad公司），OLYMPUS SZX16體視顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 NMT1基因啟動子克隆與序列生物信息學分析

茶樹基因組 DNA提取采用改良 CTAB法；啟動子擴增按照文獻[15]的 hiTAIL-PCR法，即以YH-NMT1基因5'端序列為基礎，設計3條特異的巢式引物S1-0、S1-1和S1-2，結合4條LAD簡并引物及AC1（表1）進行3輪巢式PCR擴增。首輪擴增以50 ng的茶葉基因組DNA為模板，以S1-0和LAD1—LAD4引物進行擴增；擴增產物稀釋50倍后用S1-1和 AC1引物組合進行第 2輪擴增；再將第 2輪擴增產物稀釋 10倍為模板用 S1-2和 AC1引物組合進行第3輪擴增，完成第1次擴增。第 1次擴增產物測序后，根據序列特點在其5'端再設計 3個特異性巢式 PCR引物 S2-0、S2-1、S2-2，結合4條LAD簡并引物及AC1（表1）同上進行第2次擴增并測序。兩次擴增產物PCR拼接驗證克隆后連接至pMD18-T載體轉化大腸肝菌DH5α并篩選出重組子。將得到的啟動子用啟動子在線分析軟件 PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE）和 Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html）進行轉錄調控元件分析。

1.3.2 植物表達載體的構建

據生物信息學分析結果及 CAAT-box、TATA-box等順式作用元件的線性分布，設計5'端引入Hind Ⅲ酶切位點的引物 pA-F、pB-F、pC-F、pD-F和 5'端引入XbaI酶切位點的引物p-R（表2），以鑒定含克隆啟動子的重組子為模板，用引物組合 pA-F/p-R、pB-F/p-R、pC-F/p-R、pD-F/p-R分別擴增 5'端序列依次缺失的4個啟動子。擴增引物經XbaI、Hind Ⅲ雙酶切后，插入經同樣酶切回收的pBI121載體以替換其CaMV35S啟動子。連接產物轉化大腸桿菌 DH5α并將篩選到的重組子進行PCR和測序鑒定，構建出4個5'端序列依次缺失的克隆啟動子融合GUS基因的轉基因載體pA、pB、pC、pD（圖1）。

表1 hiTAIL-PCR擴增引物Table 1 Primers of hiTAIL-PCR

表2 載體構建PCR擴增引物Table 2 Primers of PCR in the vector construction

1.3.3 GUS瞬時表達分析

將構建好的4個重組載體和pBI121載體分別用熱激法轉化農桿菌GV3101菌株，參照吳英杰等[16]的方法進行GUS瞬時表達分析。即用農桿菌滲透法侵染煙草葉片，浸染過的外植體接種在共培養基（1/2 MS+120 μmol·L-1AS）上，28℃暗培養2～3 d后GUS染色，GUS組織化學染色參照Jefferson等[17]的方法，略有改動，染色結束后用75%的乙醇脫色處理至陰性對照為白色，用體視顯微鏡進行觀察并照相。

1.3.4 煙草遺傳轉化與陽性植株篩選鑒定

將含有 pA和 pBI121的農桿菌 GV3101菌株，用葉盤轉化法[18]分別對煙草轉基因，經篩選培養（MS+200 mg·L-1Carb+75 mg·L-1Kan）獲得抗性植株。對抗性植株采用CTAB法提取基因組 DNA為模板，以未轉基因煙草為陰性對照，用引物 GUS-F：TCGGCTTTAACCTCTCTTTAG；GUS-R：ATTGTTTGCCTCCCTGCT對其 GUS基因擴增分析鑒定轉基因植株。

圖1 植物表達載體構建Fig. 1 Construction of plant expression vector

1.3.5 轉基因煙草組織 GUS化學染色及 GUS基因表達量分析

參照 Jefferson等[17]的方法對鑒定的轉基因煙草進行根、莖、葉的GUS組織化學染色，并用體視顯微鏡進行觀察并照相。轉基因煙草不同組織GUS基因表達采用實時熒光定量PCR技術，即以提取的各組織總RNA反轉錄cDNA為模板，用引物F：5'-CTCATTACGGCAAAGTG TGGGTCAA-3'和 R：5'-CAATAACATACGGC GTGACATCGG-3'擴增分析 GUS基因 mRNA表達量，以煙草β-actin基因為內參基因。

1.3.6 不同脅迫處理條件下轉基因煙草葉片GUS基因的表達分析

為檢測轉基因植株在不同脅迫處理條件下GUS基因的表達情況，以轉基因植株處理前的材料為對照（CK），對材料作如下處理：（1）正常條件下培養48 h（每天2 000 lux光照 16 h，8 h黑暗，25℃培養）；（2）黑暗及光照處理：將煙草苗置于黑暗條件下及2 000 Lux光照培養各48 h；（3）高低溫處理：將煙草苗分別置于4℃和40℃培養48 h；（4）干旱處理：澆灌濃度為 30%的聚乙二醇（PEG6000）模擬干旱脅迫，培養48 h；（5）ABA 處理：100 μmol·L-1ABA 噴灑于煙草苗葉片上，培養48 h。將對照材料及處理后的材料分別取葉片，立即用液氮速凍，并提取總RNA，利用實時熒光定量PCR檢測GUS基因的表達情況，方法同1.3.5。

2 結果與分析

2.1 茶葉DNA提取及NMT1基因啟動子克隆

采用改良 CTAB法提取茶樹葉片基因組DNA，以提取的 DNA 為模板進行hiTAIL-PCR。第1次hiTAIL-PCR利用巢式特異引物組合 LAD2引物成功擴增獲得 500 bp片段（圖1），測序分析后在其5'端再設計3個特異巢式引物進行第 2次 hiTAIL-PCR擴增，結果利用特異引物組合LAD3引物成功擴增獲得5'端延伸的約500 bp新片段（圖2），將兩輪擴增的序列據重復區拼接后獲得啟動子序列。按拼接啟動子序列5'端和3'端序列再設計特異引物從基因組中直接擴增靶啟動子序列，結果得到的序列完全等同拼接的啟動子序列，驗證了克隆啟動子的正確性，克隆的NMT1基因啟動子序列長767 bp（圖3）。

2.2 啟動子序列分析及順式作用元件預測

利用啟動子在線預測數據庫Plant Care和PLACE對克隆的NMT1基因啟動子序列進行分析，結果表明（圖4和表3），PNMT1序列中預測轉錄起始位點 TSS位于翻譯起始位點上游63 bp的堿基A處。該啟動子除具有真核生物啟動子的基本結構 TATA-BOX 和CAAT-BOX等核心元件，還含有脫落酸響應元件ABRE，厭氧誘導響應元件 ARE，茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif，熱應答元件HSE，乙烯應答元件ERE，脅迫相關應答元件TC-rich repeats，水楊酸響應元件TCA-element，以及多個光應答元件如AE-box、ATC-motif、Box-4、Box I、as-2-box 等。

圖2 hiTAIL-PCR的第2輪和第3輪Fig. 2 Secondary and third amplification of hiTAIL-PCR

2.3 植物表達載體的構建

據克隆NMT1基因啟動子元件分析結果，設計4對特異引物擴增5'端序列依次缺失的啟動子各 767、452、352、210 bp，通過重組將各啟動子片段插入到 pBI121載體，替換其GUS基因上游的CaMV35S啟動子以構建植物轉化載體。將構建的重組載體質粒進行 PCR鑒定，結果如圖5所示，各重組質粒中擴增出預期大小的啟動子片段大小與預期一致，經測序驗證表明克隆啟動子與 GUS融合的轉基因載體構建成功，分別命名為pA、pB、pC、pD。

2.4 GUS瞬時表達分析

以含pBI121的GV3101菌株為陽性對照，空GV3101菌株為陰性對照CK，將pA、pB、pC、pD重組載體分別轉入農桿菌 GV3101，利用滲透法浸染煙草葉片，經培養后進行GUS染色。結果表明，除CK未觀察到染上藍色外，其他載體轉化葉片皆染上藍色。4個重組載體載體轉化的煙草葉片隨插入啟動子長度的增加染色加深，以含全長啟動子的pA載體轉化葉片染色明顯深于其他 3個。陽性對照即pBI121轉化葉片在所有轉化葉片中染色最深（圖6）。瞬時表達結果表明所克隆的NMT1基因啟動子具驅動GUS基因表達的功能，且以全長啟動子驅動能力最強。

圖3 NMT1基因啟動子的PCR擴增Fig. 3 Amplification of NMT1 promoter

圖4 PNMT1的序列分析Fig. 4 Sequence analysis of PNMT1

表3 啟動子調控區元件分析Table 3 Cis-acting regulatory element analysis of the promoter sequence

2.5 轉基因煙草植株篩選鑒定

根據瞬時表達結果，選取含 NMT1基因全長啟動子的pA載體進行農桿菌介導的葉盤轉化法轉化煙草，以pBI121載體為陽性對照，經篩選獲得抗性植株。對各抗性植株提取葉片DNA，以非轉基因煙草為陰性對照（CK），進行GUS基因的PCR檢測，結果在選取的50株抗性植株中有37株擴增出預期GUS基因片段，而非轉基因煙草未擴增出任何片段（圖7），表明煙草轉基因成功。

2.6 轉基因煙草組織GUS化學染色及GUS基因表達量分析

選取鑒定的pA轉基因煙草植株和非轉基因煙草，分別對其根、莖、葉進行GUS組織化學染色，結果表明（圖8），非轉基因煙草各組織均無藍色斑點，轉基因煙草的根、莖、葉均檢測到藍色斑點，表明PNMT1啟動子在煙草中驅動GUS基因表達無組織特異性。采用定量PCR對轉基因煙草根、莖、葉中的GUS基因表達量進行分析（圖9），結果發現轉基因煙草不同組織中GUS基因表達量具顯著差異，根部的表達量最少，莖部的表達量居中，約為根部的1.5倍，而葉片中的表達量最高，達到根部的3倍。

圖5 重組質粒PCR鑒定Fig. 5 Identification of recombinant plasmid with PCR

2.7 不同脅迫處理條件下轉基因煙草葉片GUS基因的表達分析

為探明克隆啟動子的驅動能力與外界環境脅迫因子的關系，將 pA和 pBI121轉基因煙草分別進行不同程度的光照、溫度、干旱、激素等脅迫處理，并對處理前后的煙草葉片分別進行GUS基因表達量的分析，結果如圖10。

由圖10可知，pA轉基因煙草正常生長48 h后GUS表達量均無顯著差異，經黑暗、4℃低溫處理48 h后，GUS表達量均降低約為處理前的40%；經光照、30%PEG、ABA處理48 h后，GUS表達量分別升高約為處理前的1.4、1.4、1.6倍；經40℃處理48 h后，GUS表達量較處理前無顯著差異。而陽性對照pBI121轉基因煙草在不同條件處理前后GUS表達量均無顯著差異。由以上結果可知，克隆的 NMT1基因啟動子驅動外源基因表達受外界環境因子的脅迫影響。

圖6 GUS瞬時表達檢測Fig. 6 Detection of GUS transient expression activity

圖7 部分轉基因煙草基PCR鑒定Fig. 7 The identification of partial transgenic tobacco with PCR

圖8 轉基因煙草組織GUS表達檢測Fig. 8 Detection of GUS expression activity in transgenic tobacco tissues

圖9 轉基因煙草組織GUS基因表達量分析Fig. 9 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco tissues

圖10 不同處理條件下轉基因煙草GUS基因表達量分析Fig. 10 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco under different conditions

3 討論

啟動子在功能基因的表達與調控方面起著重要作用，啟動子分離及相關研究一直是分子生物學研究的熱點。在啟動子分離方面，因所研究材料的基礎背景不同呈現技術多樣化。對全基因組已測序的生物，經設計特異引物即可擴增獲得啟動子，如 Yang等[19]對擬南芥pGC1基因啟動子的克隆。對于沒有基因組信息的生物，啟動子分離技術主要包括兩類：通過構建基因組文庫再篩選出啟動子，或是利用TAIL-PCR等側翼序列擴增技術分離啟動子。Tai等[13]通過構建基因組文庫篩選克隆了茶樹LAR、TCS、TS基因啟動子。但基因組文庫構建由于難度高、工作量大，限制了在啟動子克隆上的應用。以 TAIL-PCR及其改良hiTAIL-PCR[15]為代表的靶基因側翼序列分離技術，因具有簡單快捷的優點，在啟動子的分離上成功得到應用[20-21]。在本研究中，針對茶葉沒有詳細基因組信息可借鑒的客觀情況，采用hiTAIL-PCR技術對茶樹咖啡堿合成酶家族成員 NMT1基因的啟動子進行克隆，成功獲得靶基因的上游啟動子序列，經NewPLACE、Plant CARE等[22-24]多個在線分析軟件的分析預測，表明所分離的序列含有 TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動子基本元件及多個與植物非生物脅迫相關的響應元件，確認克隆到靶基因的啟動子，證明了所用技術的高效便捷性。

對分離到的啟動子進行功能測定分析，是啟動子研究的重要內容。將啟動子連接報告基因構建表達載體，通過瞬時表達或轉基因技術分析報告基因在宿主體內的表達特性，可以確定啟動子驅動基因表達的特點[25]。有研究表明，啟動子驅動基因的表達需要多個順式調控元件，這些元件的種類和數量以及彼此之間的順序、距離，都可能影響基因能否轉錄及轉錄的程度[26-27]。林文秋等[28]在研究菠蘿SERK基因啟動子時發現啟動子越長其驅動報告基因表達的活性越強。本研究將克隆的啟動子與GUS基因融合，在煙草葉片中進行瞬時表達，發現NMT1基因啟動子越長驅動GUS基因表達的活性也越強，印證了前人對相關啟動子活性研究的結果。另外，敬帆等[29]對蠟梅CpAGL6基因啟動子功能特性研究發現，同一啟動子在不同組織部位具有差異的驅動能力，曹華雯[30]和Li等[31]更是發現，啟動子的功能還受到干旱、鹽、ABA和低溫等脅迫誘導的影響。本研究對克隆的啟動子研究發現，其能驅動報告基因在轉煙草的葉、莖、根中的表達，但以葉片中表達最高而根中表達最低，并發現其功能受外界環境脅迫因子包括光照時間、干旱、激素、溫度的影響，表明本次所分離的啟動子功能雖無組織特異性，但具有組織間差異的驅動能力，并且其驅動功能還受外界環境脅迫因子的影響，體現了克隆啟動子功能表達的復雜性。有關 NMT1基因啟動子如何精密驅動對基因的表達還在深入研究中。