御唐丸對糖尿病大鼠胰島β細胞中PDX-1mRNA及蛋白表達的影響

鄭 南，謝 寧，張佩青，高麗娟

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150000；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）作為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，其發(fā)病機制尚未完全明確，臨床患者多產(chǎn)生內(nèi)分泌代謝障礙，以多飲、多食、多尿、消瘦以及慢性持續(xù)性血糖濃度升高為主要表現(xiàn)[1]。中醫(yī)治療DM歷史悠久，對DM發(fā)病原因及發(fā)病機制具有自己獨到見解[2]，運用中醫(yī)學(xué)理論防治DM及其并發(fā)癥也已成為治療糖尿病的有效手段[3]。導(dǎo)師謝寧教授在大量動物實驗和臨床實踐的基礎(chǔ)上，結(jié)合歷代名醫(yī)治療消渴病的寶貴經(jīng)驗和大量珍貴文獻，擬定方劑御唐丸，前期大量實驗證明該藥能夠有效改善2型糖尿病胰島素抵抗。胰腺十二指腸同源盒-1（PDX-1）主要在胰島細胞中表達，是至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子[4]。PDX-1mRNA表達不僅可維持胰島β細胞功能，還可保證胰島素的合成與分泌。御唐丸對T2DM的治療作用，是否涉及到對于PDX-1的調(diào)控作用的影響，本實驗基于此來進行研究。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級健康雄性SD大鼠150只，8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（黑）2017-012。御唐丸：主要成分由黃芪、白芍、玉竹、山茱萸、烏梅、龜板、鹿茸、女貞子、西洋參、山藥、麥冬、葛根等組成，由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn)。糖尿樂：0.31 g /片，鄭州韓都藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20050771。格華止：0.85 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20023371。鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma公司；游離脂肪酸測定試劑盒（NEFA）購于南京建成生物科技有限公司；蘇木精-伊紅生物染色劑購于上海譜振生物科技有限公司；PDX-1試劑及β-actin抗體購買于美國CST公司；Super-GL ECL 超敏發(fā)光液、蛋白裂解液購買于上海艾博思生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑購于美國Roche公司。

1.2 模型制備 將150只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量分層隨機分為空白組20只，造模組130只。空白組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，造模組喂養(yǎng)高脂高糖飼料，連續(xù)喂養(yǎng)10周后，禁食水12 h，造模組給予1%STZ溶液30 mg/kg腹腔注射，空白組給予檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2 mL腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測定大鼠空腹血糖，選取空腹血糖≥16.7 mmol/L，判定T2DM成模，實驗成功復(fù)制模型大鼠102只。

1.3 分組及給藥 隨機選擇100只成模大鼠分為模型對照組（模型組）、御唐丸高劑量組（中高組）、御唐丸低劑量組（中低組）、糖尿樂組（中對組）、格華止組（西對組），每組20只。未經(jīng)造模處理的20只大鼠作為空白組，各組大鼠組內(nèi)進行標(biāo)記。按照大鼠與人等效劑量折算，中高組給予2.70 g/（kg·d）、中低組給予1.35 g/（kg·d）、中對組給予2.43 g/（kg·d）、西對組給予0.09 g/（kg·d）、模型組、空白組給予2 mL生理鹽水。大鼠成模當(dāng)天開始統(tǒng)一灌胃給藥，連續(xù)給藥8周后，實驗動物全部處死、取樣。

1.4 各指標(biāo)檢測方法

1.4.1 空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）及游離脂肪酸（Nonestesterified fatty acid，NEFA） 飼養(yǎng)期間，每兩周周末大鼠禁食取血，采用血糖儀測定血糖。

飼養(yǎng)結(jié)束后釆用可見光分光光度計檢測血清中游離脂肪酸，按規(guī)定操作。

1.4.2 組織病理學(xué)HE染色 石蠟切片脫蠟至水后蘇木素（H）染液5 min，分化10 s，自來水沖洗使細胞核藍化后，用蒸餾水清洗，入伊紅（E）染液1 min后，脫水透明，最終樹脂封片。

1.4.3 用RT-PCR方法檢測PDX-1mRNA表達水平 設(shè)計PDX-1的引物序列，其上游引物為5'-ATCAAAATCTGGTTCCAAAACCGTC-3'，下游引物為5'-CTCGTTGTCCCGCTACTACGTTTC-3'，置于反應(yīng)體系中進行40個變性退火延伸循環(huán)。

1.4.4 用Western Blot方法檢測PDX-1蛋白水平 將組織細胞裂解后加熱冷卻離心，去除沉淀后分離，進行電泳，轉(zhuǎn)移封閉，溫育洗滌后，進行發(fā)光檢測，曝光定影，最后分析處理蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 17.0軟件完成。計量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較應(yīng)用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖水平 從表1中可以看出：治療前，與空白組相比，模型組血糖顯著升高（P＜0.01），說明造模成功；治療2周后，與模型組相比，西對組血糖顯著降低（P＜0.01）；中低組、中高組血糖顯著高于西對組（P＜0.01）。治療4周后，與模型組相比，中低組、中高組、西對組血糖有所降低（P＜0.05或P＜0.01）。治療6周后，與模型組相比，各治療組血糖降低顯著（P＜0.01）。治療8周后，中低組、中高組血糖低于中對組（P＜0.05或P＜0.01），中低組血糖顯著高于西對組（P＜0.01）。

2.2 大鼠游離脂肪酸水平 見表2。給藥8周后，大鼠NEFA水平下降明顯：與空白組相比，模型組NEFA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，中低組、中高組、西對組NEFA水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 HE染色光鏡下觀察胰腺組織 空白組胰島細胞形態(tài)飽滿、輪廓清晰、結(jié)構(gòu)規(guī)整（圖1）；模型組胰島細胞形態(tài)萎縮、體積縮小、數(shù)目減少，部分出現(xiàn)空泡變形情況（圖2）；中高組胰島細胞少有萎縮，胞漿內(nèi)的空泡樣變性也較少（圖3）；中低組胰島細胞大量出現(xiàn)空泡變性，大小不等，毛細血管內(nèi)壁增厚（圖4）；西對組胰島細胞少量出現(xiàn)空泡變性，體積如常，毛細血管擴張充血不明顯（圖5）；中對組胰島局部區(qū)域有明顯的毛細血管擴張充血，胰島細胞有大小不等的空泡變性（圖6）。

2.4 對大鼠PDX-1mRNA表達的影響 見表2。與空白組相比，模型組PDX-1mRNA的相對表達量顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組PDX-1mRNA的相對表達量均有所增加（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.5 對大鼠PDX-1蛋白表達的影響 從表2、圖7可以看出：與空白組相比，模型組大鼠胰腺組織中PDX-1蛋白表達量顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組大鼠胰腺組織中PDX-1蛋白表達水平均有所升高，其中中低組、中高組、西對組差異顯著（P＜0.01），中對組有差異（P＜0.05）；與中對組相比，中高組、西對組、中低組PDX-1蛋白表達量有所升高（P＜0.01或P＜0.05）；中高組PDX-1蛋白表達量高于中低組（P＜0.05）。

表1 給藥前至給藥8周各組大鼠血糖變化（ ）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中對組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與西對組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01

組 別 n 0周 2周 4周 6周 8周空白組 8 5.79±0.94 5.83±0.85 6.06±0.91 5.72±0.86 5.78±0.89模型組 8 24.78±2.05## 24.36±2.61## 23.83±2.02## 23.23±2.56## 22.61±2.73##中低組 8 24.29±1.74## 24.34±2.10##■■ 21.00±2.58##△■■ 19.11±1.91##△△■■ 15.35±2.22##△△▲■■中高組 8 24.58±1.72## 23.36±2.39##■■ 19.01±2.00##△△▲ 17.46±1.89##△△ 13.35±2.00##△△▲▲中對組 8 25.89±2.30## 24.24±3.12## 21.72±2.02## 19.13±2.37##△△ 17.50±2.29##△△西對組 8 24.85±1.26## 19.23±1.88##△△ 17.08±2.61##△△ 15.85±2.20##△△ 11.83±1.91##△△

表2 各組大鼠NEFA水平、胰腺組織PDX-1mRNA、PDX-1蛋白表達水平（ ）

表2 各組大鼠NEFA水平、胰腺組織PDX-1mRNA、PDX-1蛋白表達水平（ ）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中對組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與西對組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01；與中低組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

組 別 n 空白組 模型組 中低組 中高組 中對組 西對組NEFA（μmol/L） 8 0.89±0.18 1.50±0.32## 1.25±0.28##△ 1.16±0.15#△△ 1.30±0.24## 1.14±0.14#△△PDX-1 mRNAA 5 1.64±0.11 0.97±0.14## 1.19±0.12##△■ 1.39±0.15##△△▲◆ 1.18±0.11##△ 1.43±0.16#△△▲▲PDX-1 5 1.437±0.212 0.327±0.039## 0.692±0.073##△△▲ 0.865±0.108##△△▲▲◆ 0.531±0.078##△ 0.757±0.097##△△▲▲

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 御唐丸高劑量組

圖4 御唐丸低劑量組

圖5 格華止組

圖6 糖尿樂組

圖7 對大鼠PDX-1蛋白表達的影響

3 討論

葡萄糖能夠?qū)σ葝u素的基因表達及內(nèi)分泌系統(tǒng)胰島β細胞合成并分泌胰島素產(chǎn)生誘導(dǎo)，但若血糖濃度長時間維持在較高的狀態(tài)，反而會對其產(chǎn)生抑制。這種狀況也同樣發(fā)生于游離脂肪酸（FFA）對血糖濃度的調(diào)節(jié)中，血漿中FFA的濃度長時間維持在較高狀態(tài)，反而會對胰島素的基因表達及內(nèi)分泌系統(tǒng)胰島β細胞合成并分泌胰島素產(chǎn)生抑制，上述兩種抑制作用分別被稱為“高糖毒性”和“高脂毒性”[5]。

血糖濃度增高的主要原因是機體內(nèi)胰島β細胞合成并分泌胰島素或是胰島素在機體內(nèi)被利用的過程發(fā)生障礙[6]。胰腺十二指腸同源盒-1（PDX-1）主要在胰島細胞中表達，是至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，包含同源的胰島素DNA啟動子結(jié)構(gòu)域。PDX-1具有對胰島細胞的凋亡產(chǎn)生抑制、對胰島細胞定向分化產(chǎn)生促進作用的功能[7]。PDX-1對胰島β細胞中含有的特異基因表達、胰島細胞分化增殖和胰腺發(fā)育均具有調(diào)節(jié)作用。此外，PDX-1對胰淀素、葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2等在胰島素分泌過程中與之相關(guān)的基因表達亦具有調(diào)節(jié)作用[8]。相關(guān)研究也表明，體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過激活JNK，參與調(diào)節(jié)PDX-1核/質(zhì)易位，抑制PDX-1mRNA表達，導(dǎo)致DNA和PDX-1相結(jié)合的能力明顯降低，從而阻礙胰島素基因進行表達。因此，PDX-1mRNA表達正常不僅對胰島β細胞正常功能的維持具有重大意義，還可保證胰島素的合成與分泌正常進行。

糖尿病患者體內(nèi)長期處于“高糖毒性”和“高脂毒性”環(huán)境，其血漿中葡萄糖FFA的濃度長時間維持在較高的狀態(tài)，且機體消除能力不足，導(dǎo)致機體新陳代謝生成大量RNS及ROS，可以對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)甚至是DNA直接進行氧化破壞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。實驗表明[9]，JNK通路與T2DM的發(fā)病及胰島素抵抗關(guān)系密切，JNK信號通路被激活后能夠?qū)毎麅?nèi)的DNA與PDX-1相結(jié)合的能力進行調(diào)節(jié)[10]。

中醫(yī)藥治療DM的作用機制具有多層面、多方向及多靶點等顯著特點，能夠有效降低和延緩DM及其并發(fā)癥的發(fā)生[11-13]。本實驗通過對JNK信號通路相關(guān)因子的研究，證實了御唐丸能夠促進精微物質(zhì)在體內(nèi)的消化吸收，增強體內(nèi)胰島素的靶細胞、靶組織對胰島素的敏感性，能夠在減少血糖的來源的同時增加血糖的去路，從而降低血糖濃度，有效改善T2DM大鼠糖脂代謝，還可上調(diào)PDX-1mRNA的表達，促進PDX-1蛋白表達，進一步說明了御唐丸能夠通過調(diào)控JNK信號通路改善胰島素抵抗,對胰島組織進行修復(fù)，進而使血糖濃度降低[14-15]。