護心康對TLR4?/?小鼠動脈粥樣硬化模型FZD的影響*

董曉斐，丁小玉，賀佳幸，屈 波（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，湖南長沙 4007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，湖南長沙 40208）

動脈粥樣硬化發(fā)病機制尚未闡明，目前公認其與血脂代謝紊亂有關(guān)，與高脂血癥的關(guān)系尤為密切[1]。Wnt信號通路與動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病密切相關(guān)，可能成為控制動脈粥樣硬化的新靶點[2]。激活Toll樣受體4（TLR4）可介導(dǎo)動脈粥樣硬化血管壁炎癥，抑制TLR4是否影響Wnt信號的表達，尚未見報道。既往研究表明，護心康對動脈粥樣硬化具有較好的防治效果。本研究通過TLR4基因敲除小鼠（TLR4-/-小鼠）動脈粥樣硬化模型，觀察Wnt信號通路中卷曲蛋白（FZD）的變化及護心康的干預(yù)作用，探討護心康防治動脈粥樣硬化的作用機制，為動脈粥樣硬化的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級TLR4-/-小鼠70只，6周齡，體重（20.3±2.5）g，雌雄各半，購自南京大學(xué)模式動物研究所，合格證號：201800971。普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，高脂飼料由上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)提供。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室。所有研究人員均人道地進行動物實驗，嚴格遵守動物實驗倫理條例。

1.2 儀器與試劑 羅氏公司Cobas8000全自動生化分析儀及配套膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油檢測試劑盒。美國GBI公司兔抗小鼠FZD單克隆抗體、PV-6002羊抗小鼠IgG/辣根過氧化物酶（HRP）聚合物。美國R&D公司W(wǎng)nt抑制因子（WIF）。日本Olympus公司BX-51型光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影系統(tǒng)。輝瑞公司阿托伐他汀鈣片（每片20mg，國藥準字H20051408）。護心康片由湖南省中醫(yī)研究院附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)[（湘）衛(wèi)藥劑（2003）12第 039號]，由瓜蔞皮、薤白、陳皮、遠志、法半夏、茯苓、蓽澄茄、石菖蒲、旋覆花、隔山消、苦杏仁、茜草、三七、丹參、蒲黃、五靈脂、琥珀、北山楂、葳蕤、黃芪、炙甘草等組成，每片含生藥0.3 g。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及處理 隨機選取SPF級TLR4-/-小鼠12只納入正常對照組，予以普通飼料喂養(yǎng)。其余58只予以高脂飼料喂養(yǎng)13周，飼料含脂肪21%，膽固醇0.15%[3]；13周后隨機抽取5只解剖觀察胸主動脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)斑塊為造模成功；造模過程中死亡5只小鼠。造模成功的小鼠隨機分為模型組、護心康組、阿托伐他汀組、WIF組，每組12只。正常對照組不做處理，其余各組均予灌胃和腹腔注射處理，灌胃容積均為0.5 mL，腹腔注射容積均為0.3 mL，每日1次。模型組予以生理鹽水灌胃并腹腔注射；護心康組按動物與人體的等效換算法，給予生藥劑量21.6 g/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理鹽水；阿托伐他汀組按3 mg/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理鹽水；WIF組給予WIF 2 μg，生理鹽水稀釋后腹腔注射，生理鹽水灌胃。上述處理時間均為8周。

1.3.2 指標觀測 于第21周末，3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，心臟針刺采血，參照儀器及試劑盒說明書檢測血脂水平。打開小鼠胸廓，充分顯露心臟，分離主動脈，取胸主動脈固定于4%多聚甲醛中，乙醇脫水及二甲苯透明后石蠟包埋、切片，常規(guī)脫臘、脫水后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下進行病理學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)法測定FZD，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，棕黃色顆粒越多，表達水平越高。400倍光鏡觀察切片，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析，每張切片分析5個連續(xù)視野，計算均值作為測量結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗。P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血脂檢測 模型組血脂水平較正常對照組明顯升高（P＜0.05）；阿托伐他汀和護心康對膽固醇和低密度脂蛋白的升高具有明顯的療效（P＜0.05），WIF的降低作用不明顯（P＞0.05）。3種藥物處理對三酰甘油和高密度脂蛋白的影響相對較小，見表1。

表1 各組血脂檢測結(jié)果（±s，mmol/L）

表1 各組血脂檢測結(jié)果（±s，mmol/L）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與阿托伐他汀組比較，cP＜0.05

高密度脂蛋白1.42±0.35 2.64±0.41a 1.80±0.34 1.96±0.23 1.83±0.29組別正常對照組模型組阿托伐他汀組WIF組護心康組n 12 12 12 12 12膽固醇1.85±0.23 3.21±0.50a 1.83±0.37b 2.97±0.28c 2.01±0.36b三酰甘油1.21±0.25 2.52±0.45a 1.68±0.40 1.74±0.25 1.81±0.52低密度脂蛋白0.45±0.37 0.92±0.26a 0.36±0.19b 0.73±0.20a 0.43±0.28b

2.2 病理學(xué)觀察 處理21周后光鏡觀察胸主動脈。正常對照組無斑塊形成，主動脈管壁分層清楚，內(nèi)膜平整光滑，內(nèi)皮細胞排列整齊，平滑肌細胞走形良好。模型組動脈內(nèi)膜明顯增厚，大量斑塊形成，血管腔明顯減小，表明造模成功。各藥物干預(yù)組小鼠動脈內(nèi)膜均不同程度增厚，伴粥樣斑塊形成，但與模型組相比，斑塊病變減輕，斑塊面積變小，泡沫細胞減少。

2.3 FZD檢測 模型組FZD表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；與模型組相比，3種藥物處理組FZD表達水平均降低（P＜0.05），但3種藥物處理組間FZD表水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表2。

圖1 各組FZD表達光鏡觀察（HE染色，400×）

表2 各組FZD表達定量檢測（±s）

表2 各組FZD表達定量檢測（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常對照組模型組阿托伐他汀組WIF組護心康組FZD 16.20±4.38 39.15±5.41a 35.50±4.17ab 34.37±4.72ab 36.43±4.63ab n 12 12 12 12 12

3 討 論

基礎(chǔ)研究和臨床研究均表明動脈粥樣硬化的發(fā)生與高血脂密切相關(guān)。高血脂可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能障礙，脂質(zhì)沉積，同時誘導(dǎo)單核細胞浸潤血管壁，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，誘發(fā)慢性血管炎癥，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。Wnt是由19個蛋白分子構(gòu)成的分泌蛋白家族，通過分泌蛋白與細胞膜上的受體結(jié)合，激活相應(yīng)的基因表達，從而影響細胞黏附和炎癥因子的釋放等生理病理過程。Wnt信號通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩大類，Wnt/β-catenin信號通路屬于經(jīng)典型通路，也是Wnt通路研究熱點。Wnt與細胞膜上的受體FZD結(jié)合，在低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的協(xié)助下，導(dǎo)致散亂蛋白磷酸化，使細胞質(zhì)中β-catenin增多并向細胞核轉(zhuǎn)移，進而與T淋巴細胞因子/淋巴細胞增強因子發(fā)生相互作用，激活相關(guān)靶基因，從而影響下游炎癥因子表達和細胞黏附[4]。FZD屬于Wnt/β-catenin通路的上游因子，表達于多種細胞胞膜。有研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中FZD表達水平明顯升高，提示其可能參與了動脈粥樣硬化的形成[5]。激活血管內(nèi)皮細胞胞膜FZD，可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附性增強，使單核細胞易于黏附于內(nèi)皮，從而誘發(fā)血管壁炎癥[6]；同時，F(xiàn)ZD也可激活Wnt/β-catenin通路，導(dǎo)致促炎細胞因子釋放增加，表明其在炎癥中發(fā)揮著重要作用[7]。激活Wnt信號通路可導(dǎo)致脂代謝紊亂，損傷內(nèi)皮細胞，說明其與高血脂有密切關(guān)系[8]。以上研究結(jié)論都提示：Wnt信號通路與動脈粥樣硬化形成的多個環(huán)節(jié)有關(guān)，與高血脂和炎癥的關(guān)系尤為密切；FZD做為Wnt受體，在其中起著重要的作用。

中醫(yī)學(xué)認為，動脈粥樣硬化的主要病理基礎(chǔ)是痰濁和瘀血，因此常采用活血化瘀和祛痰消濁治療。護心康主要具有消痰散結(jié)和活血行瘀的作用，對冠心病有較好的療效。有研究發(fā)現(xiàn)，護心康對痰瘀阻絡(luò)型冠心病具有較好的療效，能有效改善心絞痛的發(fā)作癥狀和心電圖表現(xiàn)，以及提高患者生存質(zhì)量[9-10]。護心康可降低冠心病患者血清超敏C反應(yīng)蛋白和可溶性細胞間黏附分子1（sICAM-1）水平[11]。血清超敏C反應(yīng)蛋白是判斷炎癥的靈敏指標，其表達水平下降可減少單核細胞分泌炎癥因子；血清sICAM-1水平降低可減少炎癥導(dǎo)致的細胞黏附。護心康通過降低二者的表達，減輕炎性反應(yīng)，延緩冠心病的發(fā)生、發(fā)展。

筆者前期以兔動脈粥樣硬化為模型，發(fā)現(xiàn)護心康能有效降低血脂[12]，抑制動脈粥樣硬化斑塊中TLR4、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達[13-14]，同時抑制內(nèi)皮細胞髓樣分化因子88（MyD88）和 TNF相關(guān)因子 6（TRAF6）的表達[15]，進而發(fā)揮延緩血管壁炎癥的作用。敲除TLR4基因?qū)用}粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的影響尚未明確。本實驗研究結(jié)果顯示：高脂飼料喂養(yǎng)的TLR4-/-小鼠，血脂水平明顯升高，動脈內(nèi)膜增厚，動脈粥樣硬化斑塊形成，血管腔狹窄，說明單純抑制TLR4并不能減緩高脂誘發(fā)的動脈粥樣硬化的發(fā)生，即動脈粥樣硬化是由多因素共同作用所致，單一靶點處理很難起到最佳效果。本研究中，模型組FZD表達水平較正常對照組明顯增高，進一步證實動脈粥樣硬化與Wnt信號通路存在緊密聯(lián)系。采用降血脂藥物阿托伐他汀、WIF及中藥復(fù)方護心康對動脈粥樣硬化模型進行干預(yù)，結(jié)果顯示3種藥物均能抑制FZD，其作用無明顯差異。此外，護心康和阿托伐他汀可以明顯降低膽固醇和低密度脂蛋白水平，高密度脂蛋白水平升高則可能是膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白刺激引起的應(yīng)激性增高，屬于保護性升高。

綜上所述，護心康可能通過抑制FZD，導(dǎo)致Wnt/βcatenin信號通路受到抑制，減弱了下游炎性反應(yīng)，最終起到抑制動脈粥樣硬化的作用。