Treg細(xì)胞及其效應(yīng)因子Foxp3與反復(fù)自然流產(chǎn)相關(guān)性的Meta分析

趙心煜，徐 佳（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院檢驗(yàn)與影像學(xué)院，河南新鄉(xiāng)450052）

反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）是指育齡女性連續(xù)2次或2次以上在妊娠28周以前、胎兒體重1 000 g以下時(shí)，胚胎自動(dòng)停止發(fā)育而流產(chǎn)的現(xiàn)象[1]。RSA發(fā)病率隨著流產(chǎn)次數(shù)增加而增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2次流產(chǎn)孕婦RSA發(fā)病率為5%，3次流產(chǎn)孕婦RSA發(fā)病率則可達(dá)到73%[2]。RSA病因復(fù)雜，與遺傳、感染，及免疫、生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)異常等多種因素有關(guān)，其中免疫因素與RSA發(fā)病密切相關(guān)[3]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）主要是指具有免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)節(jié)作用的CD4+CD8+T細(xì)胞，在誘導(dǎo)免疫耐受及抑制自身免疫反應(yīng)中具有重要作用[4]。部分RSA孕婦外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于比非RSA孕婦，但也可能無(wú)差異。因此，本研究利用Meta分析的方法，通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外RSA與Treg細(xì)胞及其效應(yīng)因子相關(guān)性的病例-對(duì)照研究，加大研究樣本量，以減少因樣本量較小或研究水平、方法不同引起的偏倚，從而為RSA病因?qū)W研究及診療提供循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 研究類型 涉及Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子Foxp3與RSA相關(guān)性的病例-對(duì)照研究。

1.1.2 研究對(duì)象 （1）RSA組：連續(xù)發(fā)生2次或2次以上自然流產(chǎn)20～45歲中國(guó)女性患者（診斷標(biāo)準(zhǔn)：生殖器官無(wú)器質(zhì)性病變，內(nèi)分泌功能無(wú)異常，夫婦染色體顯帶核型分析正常，男方生育因素未見(jiàn)異常，排除感染因素，未接受相關(guān)治療）。（2）對(duì)照組包括正常早孕組和健康非孕組。正常早孕組：與RSA組同期隨機(jī)抽取的孕周3～12周健康妊娠女性，年齡與RSA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），既往順利妊娠至少1胎，無(wú)自然流產(chǎn)史、死胎、死產(chǎn)史，無(wú)生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、感染、遺傳等方面的異常，無(wú)自身免疫性疾病。此次妊娠過(guò)程中未出現(xiàn)腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀與體征，超聲顯示胚胎發(fā)育正常。健康非孕組：與RSA組同期隨機(jī)抽取的為己婚、已生育女性，既往順利妊娠至少1胎，無(wú)自然流產(chǎn)史、死胎、死產(chǎn)史，月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、感染、遺傳等方面的異常，無(wú)自身免疫性疾病。

1.1.3 研究指標(biāo) 研究對(duì)象靜脈血Treg細(xì)胞數(shù)量、Foxp3表達(dá)水平。

表1 Treg細(xì)胞相關(guān)研究文獻(xiàn)基本特征

1.1.4 相似文獻(xiàn)處理 若出現(xiàn)相似研究報(bào)道（如研究對(duì)象、研究人員、研究時(shí)間、研究類型等相似），納入紐卡斯?fàn)?渥太華量表（NOS量表）質(zhì)量評(píng)分高、結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)全面的研究。

1.1.5 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）重復(fù)報(bào)告的文獻(xiàn)；（2）不能獲取全文或信息量少的文獻(xiàn)；（3）綜述或論著類Meta研究文獻(xiàn)；（4）基礎(chǔ)研究類文獻(xiàn)，如細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究等；（5）重要數(shù)據(jù)報(bào)告不清或缺失的文獻(xiàn)；（6）NOS量表評(píng)分過(guò)低（＜5分）的文獻(xiàn)。

1.2 檢索策略 計(jì)算機(jī)聯(lián)合檢索CNKI、VIP、Wanfang Data、PubMed、Elsevier、EMbase、Web of Science 電子期刊數(shù)據(jù)庫(kù)，關(guān)于Treg細(xì)胞及Foxp3的病例-對(duì)照研究，始末時(shí)間為建刊至2016年10月。中文檢索式為：（1）（“Treg”或“CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞”）與（“反復(fù)自然流產(chǎn)”或“原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”或“流產(chǎn)”）；（2）“Foxp3”與（“反復(fù)自然流產(chǎn)”或“原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”或“流產(chǎn)”）。英文檢索式為：（1）（“regulatory T cells”or“Treg”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）；（2）（“forkhead box P3”or“forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3”or“Foxp3”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）。

1.3 文獻(xiàn)篩選、資料提取與質(zhì)量評(píng)價(jià) 由2位研究者獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選，并使用設(shè)計(jì)好的表格提取資料，若遇分歧，則討論決定是否納入，若無(wú)法達(dá)成一致意見(jiàn)，則請(qǐng)第三者裁決。提取研究的基本資料包括：第一作者、發(fā)表雜志、發(fā)表時(shí)間、平均年齡、例數(shù)、研究結(jié)果、檢測(cè)方法。采用NOS量表對(duì)檢索到的文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括病例選擇、基線可比性、暴露因素的測(cè)量，共8條，合計(jì)9分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用RevMan5.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先采用RevMan5.3軟件中的Q-檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.1）對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行異質(zhì)性分析，并用I2值評(píng)價(jià)異質(zhì)性大小，若I2＜50%，表明異質(zhì)性較小或異質(zhì)性可忽略，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；若I2＞50%，表明研究間具有較明顯異質(zhì)性或異質(zhì)性不能忽略，若各研究間有統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性而無(wú)臨床異質(zhì)性或無(wú)臨床意義，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。因本Meta分析的研究指標(biāo)為連續(xù)型變量，故以均數(shù)差（MD）或標(biāo)準(zhǔn)均數(shù)差（SMD）及95%置信區(qū)間（95%CI）為效應(yīng)指標(biāo)。最后采用漏斗圖對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)偏倚檢驗(yàn)（α=0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果、納入研究的基本特征及質(zhì)量評(píng)價(jià) 通過(guò)檢索策略檢索到中英文文獻(xiàn)共1 646篇，由2名工作人員嚴(yán)格按照文獻(xiàn)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)初篩、精篩、終篩，最終納入24篇文獻(xiàn)，其中Treg細(xì)胞相關(guān)文獻(xiàn)15篇，F(xiàn)oxp3相關(guān)文獻(xiàn)9篇。納入研究的基本特征見(jiàn)表1～2。

表2 Foxp3相關(guān)研究文獻(xiàn)基本特征

2.2 Meta分析結(jié)果

2.2.1 RSA組與正常早孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比的比較 共納入11篇文獻(xiàn)[6-14，16-17]，RSA患者459例，正常早孕女性396例。各研究結(jié)果之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性（I2=77%，P＜0.05），故采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并分析。因各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應(yīng)值。結(jié)果顯示，RSA組與正常早孕組相比，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比明顯減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD=-2.45，95%CI（-2.85，-2.04），P＜0.05]，見(jiàn)圖1。

2.2.2 RSA組和健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比的比較 共納入 10 篇文獻(xiàn)[5，8-12，15，17-19]，RSA 患者384例，健康非孕女性325例。各研究結(jié)果之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)（I2=97%，P＜0.05），但因無(wú)臨床異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并分析。各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應(yīng)值。結(jié)果顯示，RSA組與健康非孕組相比，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比明顯減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD=-2.45，95%CI（-3.65，-1.25），P＜0.05]，見(jiàn)圖2。

2.2.3 正常早孕組與健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比的比較 共納入6篇文獻(xiàn)[8-12，17]，正常早孕女性269例，正常非孕女性257例。各研究結(jié)果之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)（I2=97%，P＜0.05），但因無(wú)臨床異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并分析。各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應(yīng)值。結(jié)果顯示，正常早孕組與健康非孕組相比，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD=0.18，95%CI（-1.06，1.42），P＜0.05]，見(jiàn)圖3。

2.2.4 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達(dá)水平分析 共納入 9 篇文獻(xiàn)[11，19，20-26]，RSA 患者 343 例，正常早孕女性355例。因檢測(cè)Foxp3 mRNA表達(dá)水平的方法包括RT-PCR和qRT-PCR，為避免方法學(xué)異質(zhì)性影響結(jié)果的可靠性，故根據(jù)檢測(cè)方法的不同分為2個(gè)亞組（RT-PCR亞組和qRT-PCR亞組）進(jìn)行Meta分析。亞組分析結(jié)果顯示，各研究結(jié)果之間仍具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性，但因無(wú)臨床異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并分析。因各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應(yīng)值。分析結(jié)果顯示，RSA組與正常早孕組相比，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平明顯減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD=-5.52，95%CI（-7.38，-3.65），P＜0.05]，見(jiàn)圖4。

圖1 RSA組與正常早孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比Meta分析

圖2 RSA組與健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比Meta分析

圖3 正常早孕組與健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比Meta分析

圖4 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達(dá)水平Meta分析

2.2.5 敏感性分析及發(fā)表偏倚 為保證結(jié)果穩(wěn)定性，逐一剔除每個(gè)研究，再對(duì)剩下的研究進(jìn)行Meta分析，檢測(cè)本研究結(jié)果的敏感性。結(jié)果顯示，剔除任何一項(xiàng)研究前后，效應(yīng)值SMD未有明顯變化。采用漏斗圖對(duì)各研究指標(biāo)進(jìn)行發(fā)表偏倚檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，漏斗圖存在不對(duì)稱性，說(shuō)明本研究納入的文獻(xiàn)可能存在發(fā)表偏倚，見(jiàn)圖5～8。

圖5 RSA組與正常早孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比漏斗圖

圖6 RSA組與健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比漏斗圖

圖7 正常早孕組與健康非孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比漏斗圖

圖8 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達(dá)分析的漏斗圖

3 討 論

Treg細(xì)胞是一種組成性表達(dá)的CD4+CD25+T細(xì)胞亞群，主要來(lái)源于胸腺，在機(jī)體中主要發(fā)揮免疫抑制作用。Treg細(xì)胞數(shù)量降低或功能缺陷可引起多種疾病，并且還參與了移植物免疫耐受。妊娠屬于一種半同種異體移植，妊娠成功與否取決于母胎之間雙向免疫調(diào)節(jié)的平衡，在這一平衡過(guò)程中Treg細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，正常早孕女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量較健康非孕女性增高[8-12]，RSA妊娠女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常早孕女性和健康非孕女性[5-11]，但章雪蓮等[12]研究顯示，RSA妊娠女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量與正常早孕女性相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。因此，RSA妊娠女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量變化尚缺乏共識(shí)。本研究綜合多項(xiàng)研究結(jié)果，通過(guò)加大樣本量，減少小樣本量對(duì)結(jié)果的影響，Meta分析結(jié)果顯示，RSA妊娠女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常早孕女性和健康非孕女性，正常早孕女性外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯高于健康非孕女性，進(jìn)一步證實(shí)RSA與Treg細(xì)胞數(shù)量降低有關(guān)，正常妊娠需具備足夠數(shù)量的Treg細(xì)胞。

Foxp3是Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，可使外周血CD4+CD25-幼稚細(xì)胞向CD4+CD25+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變，對(duì)Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持具有重要作用[17]。本次Meta分析結(jié)果顯示，RSA妊娠女性外周血Foxp3表達(dá)水平明顯低于正常早孕女性，提示RSA與Foxp3表達(dá)下降有關(guān)。結(jié)合Treg細(xì)胞數(shù)量變化特征，可以認(rèn)為RSA患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量和功能均發(fā)生異常，也正因Treg細(xì)胞的異常，導(dǎo)致母體對(duì)胎兒的免疫耐受為降低、免疫排斥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而引起病理妊娠。

文獻(xiàn)異質(zhì)性分析結(jié)果顯示，健康非孕組與RSA組、健康早孕組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例比較，其異質(zhì)性均明顯高于RSA組與健康早孕組比較結(jié)果，提示在建立Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比診斷RSA參考值時(shí)，應(yīng)以正常早孕者檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)建立參考值范圍，而且兩類人群均具有相同的妊娠機(jī)體環(huán)境，更具可比性。納入的各文獻(xiàn)中，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平具有較大差異，提示此兩項(xiàng)指標(biāo)的水平可能不穩(wěn)定，調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，而在臨床檢測(cè)中應(yīng)統(tǒng)一方法和標(biāo)準(zhǔn)，并擴(kuò)大樣本量，建立更適合的參考值。

雖然本研究為避免選擇性偏倚，進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)估，異質(zhì)性分析結(jié)果顯示各文獻(xiàn)間仍存在異質(zhì)性，這可能導(dǎo)致各研究結(jié)果不具可比性。但因各文獻(xiàn)間不存在臨床異質(zhì)性，所以采用了隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)同類研究SMD值進(jìn)行了合并，對(duì)文獻(xiàn)異質(zhì)性進(jìn)行了控制，保證了結(jié)果可靠性。敏感性分析結(jié)果顯示，逐一剔除各研究，效應(yīng)值SMD未有明顯變化，說(shuō)明本研究結(jié)果穩(wěn)定性好。但偏倚分析結(jié)果表明，各研究間存在發(fā)表偏倚，說(shuō)明現(xiàn)有的研究質(zhì)量還有待提高，這是本研究的主要局限因素。本研究是國(guó)內(nèi)第一篇關(guān)于Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子Foxp3與RSA相關(guān)性的Meta分析論文，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將多項(xiàng)研究結(jié)果合并分析，保證了結(jié)果客觀性，并且所有的研究都按照嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，所以本研究結(jié)果與實(shí)際研究結(jié)果較為接近。

綜上所述，Treg細(xì)胞數(shù)量及其相關(guān)因子Foxp3表達(dá)水平降低與RSA的發(fā)生密切相關(guān)。已有關(guān)于自身免疫性疾病和腫瘤領(lǐng)域Treg免疫治療的研究報(bào)道，若進(jìn)一步深入研究Treg細(xì)胞與RSA發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，可為Treg細(xì)胞應(yīng)用于妊娠免疫治療提供依據(jù)。但在今后的研究中需加大樣本量，提高檢測(cè)方法的精確度，進(jìn)行高質(zhì)量的病例-對(duì)照研究。