HPLC?ELSD法測定芪香益腎顆粒黃芪甲苷含量

袁 林，冉麗娟（重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所404100）

芪香益腎顆粒是由黃芪、人參、大棗、枸杞子等10味中藥，經(jīng)加水煎煮、提取，制得的一種中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾益腎的功效，主要用于氣血兩虛、脾腎不足腫瘤患者放、化療時(shí)的合并用藥，可改善癥狀，減輕放、化療引起的白細(xì)胞降低、免疫功能低下。黃芪甲苷為芪香益腎顆粒有效成分之一。目前，芪香益腎顆粒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-5496（B-0496）-2014Z。該標(biāo)準(zhǔn)要求采用薄層掃描法進(jìn)行黃芪甲苷定量檢測，相關(guān)文獻(xiàn)也采用的是薄層掃描法[1]。但薄層掃描法的缺點(diǎn)在于易受薄層板的品質(zhì)、檢測時(shí)的環(huán)境等因素影響，結(jié)果重復(fù)性差[2]。本研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）進(jìn)行黃芪甲苷定量測定。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 日本島津公司LC-20AT型高效液相色譜儀、LTⅡ型ELSD，瑞士梅特勒-托利多公司ME215S型電子分析天平（分度值0.01 mg）、CP224S型電子分析天平（分度值0.1 mg）。Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）購自北京迪馬科技有限公司。乙醚、甲醇（分析純）購自成都市科龍化工試劑廠，正丁醇（分析純）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，水為超純水，乙醇、氨水購自（分析純）購自重慶川東化工集團(tuán)有限公司。芪香益腎顆粒購自重慶天致藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：171003、171101、171201）。黃芪甲苷對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110781-201314）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 采用Diamonsil C18色譜柱，參考文獻(xiàn)[3-9]，經(jīng)過優(yōu)化條件，最后確定流動(dòng)相定為乙腈-水，比例為 35∶65，流速為 1.0 mL·min-1，柱溫為 35℃，進(jìn)樣量為10 μL，ELSD漂移管溫度為45℃，氮?dú)鈮毫?50 kPa。分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按擬定色譜條件進(jìn)樣。記錄色譜圖，見圖1。

1.2.2 樣品溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品20 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取芪香益腎顆粒，研細(xì)，精密稱取10 g，置索氏提取器中[10-12]，加乙醚40 mL，加熱回流2 h，棄去乙醚液，晾干，加甲醇50 mL，放置過夜，再加甲醇適量，加熱回流10 h，回收甲醇并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，略微加熱至溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液振搖提取4次，每次25 mL，棄去氨試液，用正丁醇飽和的水洗至中性，棄去水溶液，正丁醇溶液蒸干，向殘?jiān)屑蛹状歼m量至溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到供試品溶液。（3）陰性對(duì)照溶液的制備：根據(jù)該制劑的處方工藝流程，制備不含黃芪藥材的陰性樣品。

圖1 高效液相色譜圖

1.2.3 線性范圍實(shí)驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、8.00 mL 置 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，各吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.4 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次各10 μL，記錄色譜圖。取同一批次芪香益腎顆粒（批號(hào)：171101）制備的6份供試品溶液，分別進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖。

1.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液1份，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，各進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖。

1.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取相同批次芪香益腎顆粒（批號(hào)：171101）混勻，研細(xì)，分別稱取6份，每份約10 g，分成3組，每組分別添加濃度為0.412 5 mg·mL-1的黃芪甲苷對(duì)照品溶液各1.00、2.00、3.00 mL，充分混勻后進(jìn)樣，各進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。

1.2.7 供試品及檢測 取3批次芪香益腎顆粒（批號(hào)：171003、171101、171201），按前述方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，得到峰面積，計(jì)算黃芪甲苷濃度。

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍 線性范圍實(shí)驗(yàn)得到線性回歸方程：Y=10.543X-5.632 3（R2=0.999 6），檢測系統(tǒng)在黃芪甲苷0.196～3.136 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.2 精密度與重復(fù)性 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，黃芪甲苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%，表明檢測系統(tǒng)精密度良好。取同一批次供試品溶液6份，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，黃芪甲苷峰面積RSD為0.98%，表明檢測系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.3 穩(wěn)定性 不同時(shí)間點(diǎn)7次上樣，黃芪甲苷峰面積RSD為1.6%，表明供試品溶液中黃芪甲苷在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.4 加樣回收率 平均回收率為94.22%，RSD為1.4%，具體結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 供試品檢測 批號(hào)171003、171101、171201芪香益腎顆粒，黃芪甲苷檢測結(jié)果分別為0.165、0.173、0.160 mg·g-1。

3 討 論

3.1 供試品溶液制備條件的選擇 供試品溶液制備方法參考了《中國藥典（2015年版一部）》中黃芪藥材項(xiàng)下的方法[9]，但是進(jìn)行了改進(jìn)。有研究顯示，使用D101型大孔吸附樹脂柱與不使用該柱對(duì)黃芪甲苷的分離效果均較好，最終的檢測結(jié)果相近，所以本研究未使用該柱；因索氏提取法對(duì)供試品中黃芪甲苷的提取效果優(yōu)于直接超聲法，雜質(zhì)峰更少，故本研究采用索氏提取法[10-12]。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本研究對(duì)乙腈與水的比例進(jìn)行了多種組合實(shí)驗(yàn)，最后根據(jù)黃芪甲苷峰形，理論塔板數(shù)，與相鄰雜峰的分離度，確定乙腈與水的比例以35∶65為最佳。

本研究建立了可用于芪香益腎顆粒黃芪甲苷含量檢測的HPLC-ELSD方法，與薄層掃描法相比，該方法具有靈敏度高、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，可用于該制劑的質(zhì)量控制檢測。