Aβ1?42寡聚體對小鼠神經膠質細胞D1a IL?1β表達水平的影響研究

王鼎，李曉紅，李亞惠（1.大連醫科大學第一臨床學院，遼寧大連116044；.大連醫科大學附屬友誼醫院，遼寧大連116001）

阿爾茨海默?。ˋD）又稱老年性癡呆，是老年人群常見的中樞神經系統變性病之一，主要臨床表現包括漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等。近年來，AD發病率逐漸升高，且患者病死率隨著年齡增加逐步增高[1]。AD神經病理學改變主要包括腦組織中存在大量的β-淀粉樣蛋白（Aβ）構成的老年斑，以及神經細胞內出現由tau蛋白過度磷酸化和聚集形成的神經原纖維纏結[2]。AD發病原因及機制尚未完全明確。炎癥因子通過誘發腦組織炎性反應，進而誘發AD，可能是其發病機制之一[3-5]。白細胞介素（IL）-1是重要的炎癥因子，其家族包括IL-1α、IL-1β、IL-18及IL-1受體蛋白拮抗劑等，其中IL-1β與AD關系密切。IL-1β主要由神經膠質細胞產生和釋放，通過作用于其他細胞發揮生物學效應，最終引起神經病理學改變，促進AD發生、發展[6]。細胞外的Aβ可通過激活神經膠質細胞內的信號轉導途徑導致一系列的炎性反應，進而誘發AD[7]。然而，Aβ是否可以促進神經膠質細胞釋放IL-1β尚未明確。小鼠神經膠質細胞D1a具有星形膠質細胞的特征，活化后可通過分泌炎癥因子參與局部免疫反應。因此，本研究以D1a細胞為研究對象，結合形態學及分子生物學方法，分析了 Aβ1～42 寡聚體（Aβ1-42）與 IL-1β的相關性，旨在確定Aβ對神經細胞的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Allegra X-30R型低溫離心機（Beckman Coulter公司，美國），Mini-ProteinⅡ型電泳儀、iMark型酶標儀、Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統（Bio-Rad公司，美國），CO2培養箱（ThermoFisher公司，美國），TCSSP8型熒光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.1.2 試劑 Aβ1-42寡聚體（Sigma公司，美國），小鼠βactin、IL-1β 抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），Alexa Fluor?488羊抗鼠IgG抗體（Abcam公司，美國）。胎牛血清、Dulbecco′s改良Eagle培養基（DMEM）/高糖培養基（Invitrogen）、胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國），二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，美國），聚偏二氟乙烯膜、標準蛋白標記物（New England Biolabs公司，美國），一抗剝脫液、抗熒光淬滅劑（上海碧云天生物技術有限公司，中國上海），XAR膠片及曝光、顯影系統（OneXyi公司，加拿大）。二辛可寧酸（BCA）法蛋白檢測試劑（康為世紀生物科技有限公司，中國北京），電化學發光法（ECL）蛋白檢測試劑盒（Pierce公司，美國），實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測試劑盒（Omega、Promega公司，美國），霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（S-P）超敏鼠/兔IgG檢測試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，中國福州）。D1a細胞由筆者所在實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與處理 根據噻唑藍（MTT）實驗結果，確定Aβ1-42寡聚體處理細胞最適濃度為0.2 μg/mL。因此，將D1a細胞分為對照組和Aβ1-42寡聚體處理組。對照組給予2 μL DMSO處理。Aβ1-42寡聚體處理組給予Aβ1-42寡聚體處理，Aβ1-42寡聚體終濃度為 0.2 μg/mL。各組細胞藥物處理時間均為24 h。采用標準6孔板進行細胞接種、培養和處理，每組3孔，且處理實驗重復3次。

1.2.2 蛋白檢測 （1）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測：以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞后，刮取細胞至滅菌的離心管中，4℃、10 000r/min離心5 min，棄上清，按比例加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h；4°C、15 000 r/min離心15 min，取上清用于蛋白檢測。以10%十二烷基環酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白檢測樣品，4℃轉膜過夜，5% 脫脂奶粉封閉，IL-1β 抗體（1∶200）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL檢測后進行XAR膠片曝光、顯影。洗膜重新封閉后，β-actin抗體（1∶10 000）4°C 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，膠片曝光顯影。以β-actin作為蛋白檢測參照標準。（2）免疫熒光染色和激光共聚焦掃描檢測：PBS沖洗細胞，4%甲醛固定30 min，0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）處理30 min，室溫下加入羊血清預孵育30 min，IL-1β抗體（1∶200）4°C 孵育過夜。pH7.4、0.01mol/L PBS沖洗后，以羊抗兔 IgG 抗體（1∶200）室溫孵育 1 h，封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察結果并拍照。另采用4，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）進行細胞核染色。

1.2.3 mRNA檢測 標準方法提取處理細胞總RNA，采用qRT-PCR檢測試劑盒進行IL-1β mRNA檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.0軟件進行數據處理和統計學分析。計量資料組間兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗，P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 蛋白和mRNA檢測結果 Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，Aβ1-42寡聚體處理組D1a細胞IL-1β蛋白表達水平明顯升高。qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，Aβ1-42寡聚體處理組D1a細胞IL-1β mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 激光共聚焦檢測結果 激光共聚焦檢測結果顯示，Aβ1-42寡聚體處理組IL-1β表達水平高于對照組（P＜0.05），見圖2。

3 討 論

目前，AD發病原因及機制尚未明確，腦組織慢性持續性炎性反應可導致神經組織病理學改變，因此被認為是誘發AD和疾病持續進展的主要因素[8]。在多種因素的作用下，機體產生和釋放大量炎癥因子，誘發非特異性炎性細胞浸潤和慢性炎性反應，進而誘發AD。值得注意的是，炎性反應同時可引起Aβ在腦組織中大量沉積并逐漸形成老年斑，而老年斑的沉積最終使腦組織急性損傷轉變為慢性損傷，最終導致中樞神經系統損傷。因此，抑制炎癥因子的產生和釋放、拮抗Aβ參與炎性反應對AD的防治十分重要。

圖1 Western blot與qRT-PCR檢測結果

圖2 激光共聚焦檢測結果

存在于腦組織細胞外的Aβ是腦內淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）在β-和γ-分泌酶的裂解作用下產生的肽段，通常以單體、二聚體、低聚物和纖維狀等多種形式存在，其中纖維狀Aβ是主要的神經毒性致病物質。纖維狀Aβ大量沉積是AD發病的根本原因[9]。然而，也有研究表明，可溶性Aβ寡聚體也具有較強的神經毒性作用[10-11]。

在早期AD患者及轉基因動物腦內，Aβ老年斑沉積可刺激神經膠質細胞活化并立即和Aβ結合，進而降解、清除Aβ老年斑[12]。然而，隨著AD病情不斷進展，在致炎因素的長期作用下，活化的小膠質細胞分泌IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎癥因子。此外，星型膠質細胞和小膠質細胞在細胞間炎性反應信號傳遞過程中相互影響，小膠質細胞在吞噬、清除Aβ老年斑及釋放炎癥因子的同時，可以激活星型膠質細胞，活化后的星型膠質細胞參與清除Aβ，并同時通過分泌炎癥因子抑制小膠質細胞的活性[13]。在神經膠質細胞分泌的炎癥因子中，對IL-1的研究較多，已證實在AD患者受損的大腦皮層中，IL-1表達水平顯著升高，而且Aβ老年斑周圍活化的小膠質細胞IL-1表達水平也升高[14]。IL-1β作為IL-1主要的亞基之一，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38信號通路，上調β-淀粉樣蛋白裂解酶1（BACE1）表達水平，進而加速APP的裂解和促進Aβ沉積[15-16]。IL-1β還可通過活化膠質細胞，誘導炎癥因子的產生和釋放，產生神經毒性；通過促進tau蛋白的磷酸化，通過MAPK-p38信號通路介導神經纖維纏結[17]。

綜上所述，炎性反應在AD發生、發展過程中有著至關重要的作用。Aβ不僅直接介導炎性反應，其持續存在還可活化神經膠質細胞，釋放更多的細胞因子參與炎性反應，使AD病理學改變處于惡性循環之中，最后導致AD的發生和發展。本研究以體外實驗證實Aβ1-42寡聚體可上調膠質細胞IL-1β表達水平，驗證了Aβ1-42寡聚體與神經膠質細胞IL-1β表達水平二者間的相關性，為進一步探索Aβ和炎性反應在AD發生、發展機制中的作用奠定了一定的基礎。