Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭對抑郁癥大鼠前額葉和海馬神經元發生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響

丁迎 戢漢斌 陳鈺 蘇鄒

湖北省武漢市武東醫院（武漢市第二精神病醫院）康復科（武漢 430084）

抑郁癥臨床上常見的病癥，病因相對復雜［1］。抑郁癥主要是心情或情感性精神障礙，全球約20%的人群受抑郁癥的困擾［2］。目前，對于抑郁癥的治療方式很多，但抑郁癥很難被完全治愈。抑郁癥發病的原因是單胺類神經遞質的異常導致的［3］，但這種說法并不能充分闡釋抗抑郁癥藥物的作用機制，這說明抑郁癥的發病也有可能是由于其他神經遞質如氨基酸類神經遞質異常導致的。海馬是大腦中與情緒認知相關的區域，是一個重要的邊緣結構系統［4］。海馬作為應激反應的靶區，經常在抑郁癥和情緒應激的研究中被涉及，并可參與學習記憶和情緒反應等活動［5］。大腦前額葉皮質mPFC是控制情緒的中樞組分，抑郁癥患者的mPFC背外側區結構會發生改變［6-7］。長期慢性應激可誘發海馬和mPFC神經元受損，從而使中樞神經系統發生紊亂。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸（glutamate，Glu）是主要的抑制性和興奮性遞質［8］。在抑郁癥患者的部分腦區域中，GABA和Glu的濃度異常，平衡被破壞［9］。Toll樣受體4（Toll-like recept 4，TLR4）是Toll樣受體中最早被發現的亞型之一，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成，在多種組織和細胞中分布十分廣泛［10］。研究證實，TLR4具有促進炎癥因子分泌的功能，從而引發機體的炎癥反應。同時，TLR4還可促進免疫反應過程中免疫細胞的成熟與分化，具有抗病毒、介導全身免疫病理損傷、調節免疫應答等生理功能［11］。由于TLR4在炎癥反應中的信號轉導作用，其在與炎癥相關的疾病中的功能成為了研究的熱點。TLR4是一種模式識別受體，能夠識別壞死細胞以及熱休克蛋白（HSP60、HSP70）等。在神經受損部分會產生大量的壞死細胞以及HSP60和HSP70，故TLR4在神經損傷性疾病中的作用，受到了更多的關注。目前，對于TLR4在腦神經系統損傷中的研究仍不多。因此，本研究的創新點即是采用Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）作用于抑郁癥大鼠模型，探討TLR4對抑郁癥大鼠模型前額葉（mPFC）和海馬神經元發生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響，以為臨床診治提供理論依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器雄性SD大鼠，體質量約為240～ 280 g，合格證號：SCXK（滬）0054756，購自上海斯萊克景達有限公司。Toll樣受體4拮抗劑TAK-242購自美國MCE公司；兔抗小鼠TLR4抗體購自美國CST公司；山羊抗兔β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；組織裂解蛋白提取液和BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；5-HT ELISA試劑盒、Glu ELISA試劑盒和GABA ELISA試劑盒購自R&D公司。Western發光成像系統購自美國UVP公司；全自動酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及給藥選取60只SD雄性大鼠，適應性飼養3 d后，隨機分為2批，每批SD大鼠隨機分為3組：正常對照組（Control組）、模型組［用長期輕度不可預見性應激（CUMS）加孤養復制大鼠抑郁癥模型，Model組］和治療組［Model+TAK-242（3 mg/kg）］。第1批30只大鼠用于自發活動和強迫游泳測試；第2批30只大鼠用于5-羥色胺（5-HT）、GABA及谷氨酸Glu含量的檢測，以及TLR4蛋白表達的測定。

正常對照組大鼠進行合籠飼養，其余各組大鼠進行單只孤養。模型組和治療組大鼠建立CUMS抑郁癥模型，連續21 d接收不同的刺激，每天選取以下任意一種刺激：24 h禁水、24 h禁食、夾尾1 min、懸尾1 min、通宵照明、4℃冷水游泳5 min、100 V電擊足底1 min、40℃烘箱熱烘5 min等，順序隨機，使大鼠受到不能預料的刺激。治療組大鼠同時注射TAK-242（3 mg/kg）21 d，治療組和模型組大鼠采取腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2.2曠場試驗和強迫游泳測試（1）曠場試驗：在實驗開始前1 d和實驗開始后第22天，用ENV-520動物行為視頻跟蹤分析系統對大鼠的自發活動記錄3 min并進行分析。（2）強迫游泳測試：準備水溫為（25±1）℃的測試桶，分別于第1和22天預先強迫游泳15 min，24 h后再次強迫游泳5 min，并記錄5 min內的不動狀態時間。

1.2.3大鼠mPFC和海馬中5-HT、GABA及Glu含量的檢測3組大鼠在實驗結束后進行斷頭處死，冰上分離前額葉與海馬，置于液態氮中凍存后，可冷凍于-80℃冰箱待測。對所取的大鼠組織進行勻漿，并使用ELISA試劑盒測定大鼠mPFC和海馬中5-HT、GABA及Glu的含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4Western印跡法檢測大鼠mPFC和海馬組織TLR4的蛋白表達將大鼠的mPFC和海馬組織分別置于研缽中，加入一定體積的蛋白裂解液對組織進行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4℃下、12 000×g離心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白濃度試劑盒對其進行蛋白定量。

選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μL蛋白樣品進行上樣，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液進行封閉2 h后，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化學發光法對蛋白進行顯色，應用Image J軟件進行定量分析。

1.3統計學方法本研究用SPSS 21.0統計軟件。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1自發活動與強迫游泳不動時間如表1所示，造模前，各組大鼠自發活動總路程差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗結束后，與正常對照組相比，模型組大鼠自發活動總路程減少（P＜0.01），強迫游泳不動時間延長（P＜0.01）。與模型組相比，TAK-242治療組大鼠自發活動總路程增加（P＜0.01），強迫游泳不動時間縮短（P＜0.01），而與正常對照組相比無差異（P＞0.05）。

表1 自發活動與強迫游泳不動時間Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

表1 自發活動與強迫游泳不動時間Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

注:與正常對照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對照組模型組TAK-242治療組P值只數10 10 10-自發活動總路程（cm）造模前304.64±107.45 313.73±114.23 312.23±79.25＜0.05造模后499.43±128.14 127.24±37.17**413.85±118.32##＜0.05強迫游泳不動時間（s）93.23±10.44 131.64±17.45**183.23±11.43##＜0.05

2.2各組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量如表2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均降低（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均升高（P＜0.01）。說明TAK-242治療大鼠后，可提高大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量。

2.3各組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量如表3所示，與正常對照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量均顯著升高（P＜0.01）。說明TAK-242治療大鼠后，可提高大鼠mPFC和海馬中GABA的含量。

表2 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表2 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對照組模型組TAK-242治療組P值只數10 10 10-5-HT含量（μmol/L）mPFC 1.23±0.14 0.64±0.12**1.23±0.11##＜0.05海馬1.64±0.25 0.93±0.13**1.33±0.09##＜0.05

表3 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表3 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對照組模型組TAK-242治療組P值只數10 10 10-GABA含量（μmol/L）mPFC 58.21±16.13 37.62±13.13**73.22±18.12##＜0.05海馬154.61±35.21 52.95±15.15**213.33±44.02##＜0.05

2.4各組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量如表4所示，與正常對照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量均升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量均降低（P＜0.01）。這說明TAK-242治療大鼠后，可減低大鼠mPFC和海馬中Glu的含量。

表4 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表4 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對照組模型組TAK-242治療組P值只數10 10 10-Glu含量（μmol/L）mPFC 21.22±6.15 39.63±9.18**27.26±8.42##＜0.05海馬27.64±7.53 56.93±12.14**30.37±9.47##＜0.05

2.5各組大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比較如圖1所示，與正常對照組相比，模型組大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達量顯著下調（P＜0.01）。說明TAK-242治療大鼠后，可下調大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達量。

圖1 各組大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比較Fig.1 Comparison of TLR4 protein content in mPFC of rats in each group

2.6 各組大鼠海馬中TLR4蛋白含量的比較如圖2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠海馬中TLR4蛋白的表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠海馬中TLR4蛋白的表達量顯著下調（P＜0.01）。說明TAK-242治療大鼠后，可下調大鼠海馬中TLR4蛋白的表達量。

圖2 各組大鼠海馬中TLR4蛋白含量的比較Fig.2 Comparison of TLR4 protein contents in hippocampus of rats in each group

3 討論

抑郁癥已成為臨床上較難治愈的病癥，長期輕度不可預見性應激（CUMS）是導致抑郁癥發病的主要因素［12］。CUMS建立的大鼠抑郁癥模型能很好地模擬抑郁癥的某些癥狀和病因，因此，本研究采用CUMS加孤養建立大鼠抑郁癥模型，初步研究Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）對抑郁癥大鼠模型前額葉（mPFC）和海馬神經元發生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響。本研究證實，抑郁癥模型大鼠的自發運動比正常組減少，強迫游泳不動時間延長，即模型組大鼠的運動能力有所下降，正處于抑郁癥發病狀態，這證實抑郁癥大鼠模型建模成功。

抑郁癥的發生與腦內單胺遞質5-HT的缺乏有著密切相關［13］。本研究結果證實，與正常對照組相比，抑郁癥大鼠mPFC和海馬中的5-HT顯著降低，而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均顯著升高，這說明抑郁癥模型大鼠的發病與腦內單胺遞質5-HT的表達量低有關，同時Toll樣受體4拮抗劑TAK-242可以提高大鼠mPFC和海馬中5-HT的表達量，對抑郁癥有緩解作用。

抑郁癥的發生不僅與5-HT的表達降低有關，還與GABA和Glu有關聯。在抑郁癥的發病機制中，5-HT、Glu和GABA在情感障礙發病中發揮關鍵作用。Glu是海馬內的重要興奮性遞質，其與學習記憶和情緒控制關系密切［14-15］。GABA參與腦內胺類、肽類和氨基酸類神經遞質的調控功能，抑郁癥患者腦組織中GABA濃度較正常對照顯著下調，Glu濃度顯著上升，說明抑郁患者大腦GABA和Glu濃度失衡，大腦神經傳遞受損［16］。本研究表明，大鼠mPFC和海馬中Glu含量上升，GABA含量降低；而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中Glu含量降低，GABA含量顯著升高。Toll樣受體4拮抗劑TAK-242可提高GABA含量，降低Glu含量，夠使抑制性氨基酸與興奮性氨基酸趨于平衡，有利于恢復抑郁癥患者的正常情緒和認知功能，這可能是抑郁癥得到緩解的機制之一。

TLR4是Toll樣受體家族的I型膜受體，不僅能夠識別外源性配體，還能夠識別內源性配體，因此可被神經損傷部位的內源性配體激活［17］。TLR4在中樞神經系統疾病中發揮著重要的功能，參與腦組織損傷后的炎癥反應，包括帕金森病、阿爾茨海默病以及肌萎縮側索硬化等神經變性疾病［18-20］。本研究結果顯示，大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白與正常對照組相比表達量上調，而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白表達量下調。這說明TAK-242注射抑郁癥模型大鼠后，能夠使大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白表達量下調，推測TLR4通路與抑郁癥大鼠模型前額葉和海馬神經元發生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡有關。

本研究的新穎之處在于采用Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）作用于抑郁癥大鼠模型，同時測量前額葉和海馬神經元發生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡，從而可以全面評價Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）治療抑郁癥的效果和機制。本研究的不足是沒有評估在該過程中神經遞質的變化，這也是本課題組下一步研究的方向，即采用微透析技術探究厄立特蘭（TAK-242）治療抑郁癥時各腦區神經遞質的變化。

綜上所述，TLR4抑制劑TAK-242對SD小鼠抑郁癥具有緩解作用，其作用包括改善大鼠的自發運動能力、提高5-HT的含量、控制γ-氨基丁酸和谷氨酸的平衡以及降低TLR4的蛋白表達量。推測TAK-242的抑郁癥緩解作用可能與抑制炎癥反應有關。本研究為抑郁癥提供了新的治療思路，并為深入探討TAK-242的抑郁癥緩解機制（即抗炎分子機制）奠定基礎。