艾瑞昔布不同用藥持續時間對大鼠骨折愈合的影響

齊巍 琚紹靜 李嫻 劉偉 張瑞杰 王建生 孫柏山

唐山市第二醫院（河北唐山 063000）

非甾體抗炎藥（nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）具有解熱、鎮痛、抗炎、抗血小板聚集、抗風濕等作用［1］。尤其選擇性環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑是骨折患者傷后及術后重要鎮痛藥物。它能選擇性的抑制COX-2，抑制花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉化為前列腺素（prostaglandin，PG），從而減少炎性反應達到抗炎鎮痛的作用［2］。研究表明雖然特異性COX-2抑制劑在炎癥反應和疼痛方面起重要作用，但同時會延遲骨折的愈合［3］。國內外研究均表明選擇性COX-2抑制劑能抑制前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的合成，從而抑制如骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細胞因子的合成，影響血管內皮細胞、骨細胞的形成［4］。因此，本研究首選特異性COX-2抑制劑（艾瑞昔布），在動物實驗水平觀察探討其不同用藥持續時間對大鼠股骨骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑艾瑞昔布（生產批號：BH2017 0338）購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；兔抗鼠BMP-2和VEGF多克隆抗體均購于武漢博士德生物有限公司；ELISA檢測試劑盒訂購于武漢云克隆科技股份有限公司；柜式X線照片機購置于美國Faxitron公司；光學顯微鏡購置于日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組本實驗選取75只SPF級健康SD大鼠，體質量（350±30）g，12周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）-2016-235。飼養于華北理工大學醫學動物實驗中心SPF級屏障環境；參考《藥理實驗方法學》等效劑量折算表［5］，將艾瑞昔布溶于0.9%Nacl中配制成混懸液灌胃，實驗隨機分為正常組：生理鹽水灌胃4周；短期用藥組：艾瑞昔布混懸液2 mg/（kg·d），灌胃2周后改用生理鹽水2周；長期用藥組：艾瑞昔布混懸液2 mg/（kg·d），灌胃4周，大鼠股骨骨折模型構建成功后定時給藥，8 h/次，持續4周。

1.2.2構建動物模型10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，捆綁固定大鼠，常規備皮、消毒、鋪巾，沿右側股骨長軸行長約1～1.5 cm縱行切口，依次切開皮下組織，鈍性分離股骨干，線鋸鋸斷股骨中斷，電鉆將克氏針順行插入骨折遠端，穿過膝關節，使骨折端達到解剖復位，再將針逆行插入骨折近端，克氏針固定可靠，確保骨折端對位對線良好，縫合各層組織，常規青霉素80萬U肌肉注射，2次/d，連續3 d。

1.2.3組織標本制作攝片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法處死大鼠，打開胸腔，左心室采血5～10 mL，3 000 r/min，離心15 min，收取上層血清0.5～1 mL，-20℃保存備用。剝離取出右股骨，依次分離軟組織，拔出髓內克氏針，保護骨痂組織，截取骨折端長約1～2 cm股骨痂，0.9%Nacl沖洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脫鈣6周，每周更換脫鈣液，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿骨痂長軸方向以5 μm連續切片，切片60℃烤箱4 h，取出室溫保存備用。

1.2.4放射性（X線）檢查術后4周各組各選取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，進行X線攝片，觀察大鼠骨折端骨痂生長和骨折線模糊情況，參考LANE等［6］的X線評分系統進行評估。

1.2.5骨痂骨密度（BMD）測量術后4周各組選取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，截取右側股骨，剔除分離軟組織，拔除髓內克氏針，保護骨痂組織，以LUNAR雙能X線吸收儀掃描，以骨折端2.0 mm×2.0 mm為中心區域，測量骨痂骨密度。

1.2.6血清BMP-2和VEGF濃度測定采用ELISA試劑盒檢測，取出血清，稀釋標準品，標準品120 μL+標準品稀釋液120 μL混合均勻；參照操作說明書分別向空白孔、標準品孔及樣品孔加入相應液體，蓋上封板膜，振蕩均勻，37℃恒溫溫育60 min；配制洗滌液，揭掉封板膜，洗滌液洗滌，分別加入50 μL顯色液A、B，輕輕混勻，放入37℃恒溫箱內顯色10 min；空白孔調零，以450 nm波長測量各組的吸光度值（OD值）。

1.2.7HE染色取出石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇逐級水化，流水反復沖洗；蘇木精染色10 min，流水沖洗，細胞核著色；0.5%～1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗30 min，返藍；顯微鏡下觀察細胞核是否著色，蒸餾水洗滌洗3～5 s；0.5%伊紅染色2～3 min，流水沖洗；脫水、透明、封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.8免疫組織化學染色法取出切片，脫蠟、水化、沖洗，胰酶抗原修復30 min，PBS洗滌；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶孵育20 min，PBS洗滌；免疫染色封閉液室溫孵育60 min，PBS洗滌；滴加辣根酶標兔抗鼠BMP-2和VEGF抗體，4℃冰箱中孵育過夜，PBS洗滌；羊抗兔二抗，室溫孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色；蘇木素復染2～3 min，流水充分沖洗；1%鹽酸酒精分化3～5 s，流水沖洗，脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察并采集圖片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析。

1.3統計學方法SPSS 20.0軟件分析，實驗數據采用（±s）表示，統計學分析采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1放射學觀察及骨折愈合評分正常組骨折線模糊或消失，骨折端有連續性骨痂包繞，骨痂體積較大，骨痂愈合，骨折處髓腔再通；短期用藥組骨折線稍模糊，可見部分骨痂生長，骨折端骨痂連接不緊密；長期用藥組骨折線依然清晰可見，未見明顯骨痂生長，斷端骨痂未連接，骨折愈合欠佳。見圖1。經分析，正常組、短期用藥組、長期用藥組骨折愈合評分分別為：（4.86 ± 0.38）、（3.76± 0.32）、（2.48±0.12），各組之間差異存在統計學意義（P＜0.05），短期用藥組和長期用藥組較正常組骨折愈合評分顯著降低，其中短期用藥組和長期用藥組之間差異存在統計學意義（P＜0.05），長期用藥組較短期用藥組骨折愈合評分顯著降低。

圖1 術后4周X線情況Fig.1 Postoperative 4 weeks X-ray situation

2.2 骨痂BMD測量正常組、短期用藥組、長期用藥組骨折端骨痂BMD分別為：0.198±0.028、0.156±0.020、0.123±0.014。各組之間差異存在統計學意義（P＜0.05），短期用藥組和長期用藥組較正常組骨痂BMD顯著降低，其中短期用藥組和長期用藥組之間差異存在統計學意義（P＜0.05），長期用藥組較短期用藥組骨痂BMD顯著降低。

2.3 血清BMP-2和VEGF濃度分別測量正常組、短期用藥組、長期用藥組血清BMP-2和VEGF濃度（μg/L）分別為：（2.58± 0.52）和（2.77±0.56）、（2.10 ± 0.46）和（2.21 ± 0.50）、（1.42 ± 0.35）和（1.47±0.30）。各組之間差異均存在統計學意義（均P＜0.05），短期用藥組和長期用藥組較正常組血清BMP-2和VEGF濃度顯著降低，短期用藥組和長期用藥組之間差異存在統計學意義（P＜0.05），長期用藥組較短期用藥組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著降低。

2.4 組織學觀察正常組骨痂組織為不成熟骨組織伴有成熟骨組織，可見較多成骨細胞，骨小梁生長旺盛，排列致密有序，互相交錯網狀；短期用藥組骨痂組織為大量纖維組織軟骨組織，成骨細胞較少，可見大量軟骨細胞，骨小梁生長稍稀疏，排列有序，間隙增寬；長期用藥組骨痂組織為大量纖維組織，骨小梁生長稀疏，間隙增寬不連續，排列紊亂，大量纖維軟骨細胞，成骨細胞少見。見圖2。

圖2 HE染色觀察骨痂的形態結構變化Fig.2 Morphological changes of bone callus was observed by HE staining（× 200）

2.5 BMP-2、VEGF表達BMP-2陽性表達于成骨細胞及其周圍和骨小梁的邊緣，纖維骨痂中較少，VEGF陽性表達于成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞以及血管內皮細胞。依據免疫反應評分得出正常組、短期用藥組、長期用藥組的BMP-2、VEGF表達分別為：（3.83±0.35）和（2.98±0.25）、（3.14 ± 0.27）和（2.25 ± 0.18）、（2.46 ± 0.22）和（1.50±0.10）。各組之間差異存在統計學意義（均P＜0.05），短期用藥組和長期用藥組較正常組BMP-2和VEGF陽性表達顯著降低，短期用藥組和長期用藥組之間差異存在統計學意義（均P＜0.05），長期用藥組較短期用藥組BMP-2和VEGF陽性表達顯著降低。見圖3、4。

3 討論

圖3 免疫組化觀察骨痂組織BPM-2表達Fig.3 The BPM-2 expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

圖4 免疫組化觀察骨痂組織VEGF表達Fig.4 The VEGF expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

創傷性骨折后由諸多生長因子、細胞因子、PG等眾多因素共同參與細胞生化效應誘發的炎癥反應，并且這些因素在新骨形成及整個骨折愈合過程中產生重要作用，骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMPs）屬于轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，具有誘導間充質細胞遷徙、增殖、分化，最終導致軟骨、骨形成的作用［7］。BMP-2具有促進成骨細胞分化和誘導間充質細胞分化為成軟骨細胞和成骨細胞，導致新骨形成作用，且BMP-2可作用于破骨細胞誘導其骨吸收活性［8］。VEGF作為血管生成的最重要因子，在骨折愈合血管內皮細胞的生成發揮重要作用，能通過作用于其表面受體，促進其增殖和血管生成，為骨折的愈合提供骨再生必需的微環境［9］。同時VEGF也參與骨痂轉化、成熟的各個階段，在血管的形成、軟骨的吸收與骨痂的改建的過程中發揮重要作用。研究表明COX-2可誘導VEGF、BFGF，從而促進血管生成，加速骨折愈合率［10］。COX-2/PGE2信號轉導通路可通過上調β-catenin表達，進而激活Wnt/β-catenin信號通路上調VEGF表達。此外COX-2/PGE2信號通路還可通過VEGF作用于血管內皮細胞，促進其分裂、增殖，并誘導蛋白水解酶、間質膠原酶等促進微血管形成［11］。研究證實了COX-2高表達可以促進VEGF生成及血管內皮細胞的遷移，COX-2有促進新生血管形成的作用［12］。

TAMOTO等［13］在大鼠骨折模型采用塞來昔布（4 mg/kg·d）和羅非昔布（3 mg/kg·d）進行試驗，結果發現治療后塞來昔布組和羅非昔布組仍能發現骨折線存在。徐曉峰等［14］發現VEGF、BMP-2在骨折愈合過程中發揮重要作用。有研究表明［15］BMP-2和VEGF表達和分布在骨折愈合的不同時期各不相同，并且共同調節骨祖細胞的增殖和成骨細胞、軟骨細胞的分化，最終完成骨折修復。同樣本研究結果也表明特異性COX-2抑制劑-艾瑞昔布對大鼠骨折愈合有明顯抑制作用，尤其長期使用對骨折愈合抑制更加明顯，其可能與降低BMP-2、VEGF表達有關。

特異性COX-2抑制劑能夠緩解骨折及骨科手術后疼痛，盡管有動物實驗數據顯示特異性COX-2抑制劑對骨折愈合有不良影響，但是骨折愈合是一個多種因素參與的復雜過程，關于COX-2抑制劑與骨折愈合具體作用機制，還需進一步大量基礎實驗及臨床研究，這些方面的研究將會為我們提供新的思路。使用COX-2抑制劑抑制緩解患者疼痛可以促使患者早期活動、負重，這對骨折愈合又有促進作用，艾瑞昔布是一把雙刃劍，有利也有弊，臨床醫生應該具有足夠的警惕意識，仔細衡量利弊，做出正確的臨床決策，合理運用，對于骨折患者的鎮痛，合理的使用NSAIDs藥物，盡量縮短用藥持續時間，減少用藥劑量，使艾瑞昔布發揮最大功效。