股骨頭壞死血漿軟骨寡肽蛋白的檢測及臨床意義

龔水帝 黃俊遠 陳鎮(zhèn)秋 周迎春 劉少軍 魏秋實

1廣州中醫(yī)藥大學（廣州510405）；2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（廣州510405）

股骨頭骨壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一種在年輕患者中發(fā)病率較高的頑固性疾病，據(jù)美國統(tǒng)計每年就有2萬新增的ONFH患者，因為治療過程產(chǎn)生的高額費用，給世界經(jīng)濟造成了巨大的損失［1］。目前關(guān)于ONFH的發(fā)病機制仍未有明確的解釋，其病理過程主要是因股骨頭內(nèi)缺血性壞死造成股骨頭的壞死塌陷，并伴有股骨頭軟骨破壞。ONFH以進行性股骨頭壞死和髖關(guān)節(jié)退變?yōu)樘卣鳎珦?jù)統(tǒng)計，36%的髖關(guān)節(jié)軟骨退變在影像學被忽略掉［2］。探討新的血液標志物對診斷ONFH具有重要意義［3］。血漿COMP是一種從軟骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)糖蛋白，目前被報道用于評估關(guān)節(jié)炎軟骨退變的程度［4］。ONFH進程中同樣存在關(guān)節(jié)軟骨的退變，因此，COMP水平的改變可能在ONFH的進程中起著重要作用。目前國內(nèi)外尚無ONFH與血漿COMP的相關(guān)研究，為創(chuàng)新性地探討COMP作為ONFH的血液診斷標志物的潛在臨床價值，本研究對ONFH患者的COMP表達水平進行了檢測與分析。

1 對象與方法

1.1研究對象

1.1.1試驗組納入100例自2016年5月至2016年11月由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科收治的ONFH患者。排除肝腎功能不全、HIV感染、糖尿病、高血壓、癌癥、精神疾患不能配合等患者。

1.1.2對照組選取同時間段在本院體檢中心體檢，且年齡、性別匹配的健康者作為對照組。排除近3個月使用過降脂藥物、影響骨代謝藥物、抗焦慮抑郁藥物及激素者。本研究所有納入課題組的人員均簽署了知情同意書，且經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2實驗方法

1.2.1血漿的制備與保存試驗組及對照組均于晨起空腹抽取外周靜脈血約5 mL，統(tǒng)一編號離心后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血漿COMP的檢測使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）開發(fā)試劑盒（美國R&D Systems）測試血漿COMP水平。檢測過程嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3觀察指標（1）ONFH患者血漿COMP與疼痛時間的相關(guān)性分析。（2）試驗組與對照組血漿COMP水平差異。（3）不同ARCO分期、病因的血漿COMP水平差異。（4）血漿COMP診斷股骨頭壞死塌陷效率。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用平均值±標準差表示。兩組的性別、年齡資料比較采用卡方檢驗；兩組間血漿COMP水平差異采用獨立樣本t檢驗；不同病因、分期間的表達水平的差異采用單因素方差分析。血漿COMP水平與疼痛時間、ARCO分期采用Spearman相關(guān)分析。血漿COMP診斷股骨頭壞死塌陷的敏感性及特異性通過ROC分析比較。以上統(tǒng)計數(shù)據(jù)P＜0.05為表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料對比試驗組納入的ONFH患者共100例，其中男82例，女18例，年齡（42.34±11.68）歲。疼痛時間為疼痛出現(xiàn)到就診時間（15.03±14.88）個月。試驗組中創(chuàng)傷性10例，特發(fā)性16例，激素性30例，酒精性44例。試驗組經(jīng)ARCO分期所得：Ⅱ期30例，Ⅲ期48例，Ⅳ期22例。對照組共51例，其中男38例，女13例，年齡（43.13±10.94）歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 試驗組與對照組的一般資料對比Tab.1 Comparison of general data between test group and control group ± s

表1 試驗組與對照組的一般資料對比Tab.1 Comparison of general data between test group and control group ± s

項目例數(shù)性別（男/女）年齡（歲）疼痛時間（月）ARCO分期（例）Ⅱ期/Ⅲ期/Ⅳ期病因分型（例）創(chuàng)傷/特發(fā)/激素/酒精試驗組100 82/18 42.34±11.68 15.03±14.88 30/48/22 10/16/30/44對照組51 38/13 43.13±10.94 P值0.833 0.688

2.2試驗組組內(nèi)及與對照組組間血漿COMP水平比較（1）兩組間血漿COMP水平比較可得：試驗組血漿COMP水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（2）不同ARCO分期、病因間比較得出：①股骨頭壞死不同ARCO分期間血漿COMP水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。②股骨頭壞死塌陷前后血漿COMP水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時Ⅲ期及Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P＜0.05）。③股骨頭壞死不同病因患者的血漿COMP水平無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

2.3ONFH患者血漿COMP水平與疼痛時間相關(guān)性分析結(jié)果血漿COMP水平與疼痛時間顯著相關(guān)，與其呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.002）。見圖1。

2.4 ONFH患者血漿COMP水平與ARCO分期相關(guān)性分析結(jié)果血漿COMP水平與ARCO分期顯著相關(guān)，與其呈正相關(guān)（r=0.342，P=0.0105）。見圖2。

2.5采用ROC分析血漿COMP診斷塌陷的效率采用MedCalc軟件繪制ROC曲線，可得出區(qū)分塌陷前后的曲線下面積為0.717，敏感性為61.43，特異性為73.33，cut-off值為 ＞ 5.145 ng/mL。說明血漿COMP水平在診斷ONFH塌陷時具有一定的特異性和敏感性。見圖3。

表2 試驗組內(nèi)以及與對照組組間血漿COMP水平比較Tab.2 Comparison of levels of plasma COMP in the test group and with the control group ± s

表2 試驗組內(nèi)以及與對照組組間血漿COMP水平比較Tab.2 Comparison of levels of plasma COMP in the test group and with the control group ± s

注：與Ⅲ期比較，*P＜0.05；與Ⅳ期比較，#P＞0.05；與Ⅱ期比較，**P＜0.05；塌陷后包括Ⅲ、Ⅳ期患者

分組試驗組（n=100）對照組（n=51）ARCO分期Ⅱ期（n=30）Ⅲ期（n=48）Ⅳ期（n=22）塌陷前（n=30）塌陷后（n=70）病因創(chuàng)傷性（n=10）特發(fā)性（n=16）激素性（n=30）酒精性（n=44）濃度（ng/mL）6.132±3.481 4.774±2.358 4.595±2.827 6.735±3.834 6.912±2.889 4.595±2.827 6.790±3.544 4.081±1.900 7.260±4.349 5.456±3.320 6.484±3.314 P值0.005 0.014 0.007*0.839#0.016**0.0034 0.102

圖1 血漿COMP水平與股骨頭壞死疼痛時間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between the level of COMP in Plasma and pain duration of femoral head Necrosis

圖2 血漿COMP水平與股骨頭壞死ARCO分期的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the level of COMP in Plasma and ARCO stage of femoral head Necrosis

圖3 血漿COMP水平在診斷ONFH塌陷時的敏感性和特異性Fig.3 Sensitivity and specificity of levels of plasma COMP in the diagnosis of femoral head necrosis collapse

3 討論

3.1 COMP對ONFH的潛在診斷價值ONFH的主要特點是血液供應(yīng)不足導致骨細胞和骨髓細胞死亡以及股骨頭進行性塌陷。晚期的壞死導致骨性關(guān)節(jié)炎，可通過全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的治療，重新獲得較好的關(guān)節(jié)功能。目前，ONFH的晚期患者占所有THA手術(shù)的10%［5］，給患者及其家庭帶來了巨大的損失。早期的ONFH診斷一直是關(guān)節(jié)骨科醫(yī)生研究的重要課題，目前公認的診斷方式主要是MRI［6］，但存在價格高，患者復查依從性較低等缺點，所以需要一種簡便可行的新型早期診斷方式，為此探討生化標志物的診斷效率成為早期ONFH的重要課題。

3.2軟骨細胞與COMP的關(guān)系探討光滑的軟骨表面可以有效降低活動時的摩擦系數(shù)，減少關(guān)節(jié)間的磨損，避免關(guān)節(jié)軟骨損耗。ONFH中軟骨的退變機制最初始于缺血性骨損傷，但軟骨退變主要發(fā)生在股骨頭塌陷后［7］。一些研究表明軟骨細胞凋亡與關(guān)節(jié)軟骨退化的發(fā)生和嚴重程度成正相關(guān)［8］。

血漿COMP是軟骨細胞分泌的一種細胞外基質(zhì)蛋白，在軟骨、成纖維細胞、肌腱、韌帶等不同組織中均有表達［9］。不同原因造成的關(guān)節(jié)軟骨損傷可導致軟骨細胞與細胞外基質(zhì)的代謝失衡［10］。其中軟骨的細胞外基質(zhì)（ECM）為軟骨細胞提供營養(yǎng)和物質(zhì)，使得軟骨細胞具有彈性及對壓力有抵抗性。ECM-受體是一種跨膜蛋白復合物，通過局灶性黏附使細胞骨架與細胞內(nèi)細胞器保持建立多重連接。此外，有研究表明在ONFH中的局灶性黏附也明顯增加。COMP作為連接蛋白及其激活周圍成分的橋梁分子，亦作為蛋白質(zhì)與細胞表面之間的連接分子。COMP可與ECM的不同組分相結(jié)合，其特殊的活性使之具有調(diào)節(jié)細胞的附著、增殖和分化等重要功能［11］。因此，可以推測，較高水平的COMP通過增加細胞外基質(zhì)中的局灶性黏附促進了軟骨細胞的凋亡，進而加速破壞了關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)，進一步促進股骨頭的塌陷［4］。在ONFH的過程中發(fā)生了軟骨損傷，軟骨細胞的凋亡也進一步加劇了軟骨的退化，增加了塌陷的危險，從而形成了一個惡性循環(huán)。由此可得，COMP在軟骨細胞代謝中起著重要的作用，并且在ONFH塌陷過程中具有重要影響及預測的能力。

3.3ONFH患者的疼痛時間與COMP水平的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn)COMP與疼痛持續(xù)時間成正相關(guān)，據(jù)何偉［12］多年臨床發(fā)現(xiàn)“疼痛-不塌（穩(wěn)定）不痛，一塌（不穩(wěn)）必痛”的理論。疼痛往往意味著塌陷即將出現(xiàn)，此時隨著機體對壞死的修復，活骨與死骨間出現(xiàn)骨小梁斷裂帶，在應(yīng)力作用下進一步導致軟骨下骨板的斷裂。所以疼痛發(fā)生提示髖關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定或塌陷發(fā)生，疼痛發(fā)生的時間可以推測股骨頭不穩(wěn)定或塌陷發(fā)生的時間，塌陷過程中存在關(guān)節(jié)軟骨退變，并且隨著時間推移，軟骨破壞持續(xù)性增加，由此推斷疼痛的持續(xù)時間可反映了股骨頭塌陷的程度，并且反映軟骨退變的進展程度，本研究中COMP水平與疼痛時間呈正相關(guān)，亦從側(cè)面反映出COMP可預測股骨頭塌陷進程。當股骨頭壞死能在生化標記物的輔助下進行早期診斷，同樣可以較好把握保髖時機，我們設(shè)想COMP與疼痛持續(xù)時間成正相關(guān)，并且疼痛持續(xù)時間在一定程度上反映出塌陷的進程，那么可以建立COMP預測塌陷的進展，臨床上，疼痛≤6個月的患者是保髖治療的黃金時期。針對未塌陷者，即沒有疼痛患者，可采用非手術(shù)的保守治療，包括避免負重，中西藥物治療，體外沖擊波等物理療法等。

本研究旨在探討ONFH患者的COMP水平與疼痛時間、疾病分期、病因的關(guān)系。在此次研究中，不同的疼痛時間與COMP水平呈正相關(guān)，但不同病因的ONFH患者的COMP水平無明顯差異，這可能是因為由不同因素均可引起的軟骨細胞凋亡［13］。ONFH患者COMP水平明顯高于對照組，尤其是塌陷后組對比塌陷前組明顯增高，并且COMP水平的持續(xù)升高與ACRO分期呈正相關(guān)。目前尚未有研究對COMP與ONFH的進展程度進行相關(guān)分析，因為從本研究中得出COMP可以作為評估股骨頭塌陷的生物標志物。

綜上所述，COMP的表達增加可能在ONFH的塌陷過程中具有重要意義，其在與疾病疼痛持續(xù)時間、不同分期成正相關(guān)，且塌陷后COMP水平明顯高于塌陷前，可作為評價ONFH病情進展和指導臨床治療的敏感指標之一，但其更多的機制及實用性仍需要進一步的實驗探索及臨床驗證。