冠心病患者外周血循環內皮微粒水平檢測及意義

李南 王小敏 鐘昌寶 龍邦盛 張美萃

海口市中醫醫院1檢驗科，2重癥醫學科，3肺病心病科（海口570216）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病（coronary heart disease，CHD），是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病［1-2］。CHD及其心血管后遺癥仍然是全世界死亡的首要原因，且CHD發生率與死亡率呈現逐年上升的趨勢［3］。因此研究CHD發病機制、早期診斷和治療具有重要的顯示意義。內皮細胞源性微粒（endothelial cell-derived microparticles，EMPs）是內皮細胞在激活、損傷或凋亡時經出芽方式釋放的一類直徑介于100～1 000 nm的膜性囊泡［4-5］。本研研究主要檢測CHD患者外周血中循環EMPs水平和分析EMPs與CHD患者凝血狀態之間的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料本研究選取2015年2月1日至2017年8月1日海口市中醫醫院CHD患者120例。所有患者均經冠狀動脈造影、心電圖等檢測確診。男性85例，女性35例，年齡45～79歲，平均（59±8.1）歲。120例患者按世界衛生組織分類標準分為：穩定性心絞痛（SA）43例，男32例，女11例，平均（55±5.4）歲 ；不穩定心絞痛（UA）35例，男22例，女14例，平均（58±7.3）歲和急性心肌梗死（AMI）42例，男31例，女11例，平均（57± 6.8）歲 。所有納入研究的患者均為非血緣關系個體，并排除其他系統疾病，如急性/慢性炎癥、創傷、腦梗、周圍血管栓塞、惡性腫瘤及嚴重肝腎疾病等。排除陳舊性心肌梗死（病程6個月以上）。同期體檢健康患者20例納入對照組，其中男12例，女8例，年齡44～76歲，平均（56±6.3）歲。

1.2儀器及設備臺式離心機（Centrifuge 5810R，Eppendorf，德國）；流式細胞儀（FACS AriaⅢ，BD，美國）；CD31（1∶200）和Annexin V（1∶200）單克隆抗體購自武漢博士德（武漢），標注珠（碧云天，上海），生化分析儀（日本東芝生化分析儀，南京）。

1.3方法

1.3.1循環微粒的收集（1）用含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管收集CHD患者5 mL靜脈血樣品；（2）將樣品轉移至離心管中，4℃條件下，1 550 g離心20 min，取上清；（3）重復步驟（2），取上清，加入上清體積3倍的微粒提取液（銳博生物，廣州），充分混勻；（4）4 ℃條件下10 000 g離心10 min，以無菌PBS重懸管底沉淀；（5）重復步驟（4），以150 μL無菌PBS重懸沉淀，即獲得CHD患者循環微囊泡。

1.3.2流式細胞術（1）收集循環微粒：自外周血中收集的微粒垂懸于適量PBS中；（2）向微粒垂懸液中加入CD31（1∶200）和CD41（1∶200）單克隆抗體，室溫孵育30 min；（3）離心去除多余抗體后以PBS垂懸微粒；（4）加入熒光標記二抗（1∶200），37℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×2次；（5）以400 μL PBS重懸微粒，流式細胞儀檢測。

1.3.3總膽固醇（TCHO）、低脂密度脂蛋白（LDL）血脂、血糖、肌酸激酶（CK）和C反應蛋白（CRP）檢測采集受試者外周血5 mL，分別檢測TCHO、LDL、血脂、血糖、CK和CRP檢測等指標檢測。

1.4統計學方法應用SPSS 20.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1冠心病患者基本資料納入研究的120例CHD患者和20名健康人一般情況見表1。各組患者TCHO、LDL和血糖分析結果顯示，健康人、SA、UA、AMI組之間差異無統計學意義。檢測正常人和CHD患者外周血CK和CRP的水平后發現，SA、UA和AMI組患者CK和CRP水平明顯高于正常人，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1A、1B）。

表1 納入研究的健康人和CHD患者一般情況Tab.1 General condition of healthy subjects and CHD patients ± s

表1 納入研究的健康人和CHD患者一般情況Tab.1 General condition of healthy subjects and CHD patients ± s

注：與健康人比較，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

組別健康人SA UA AMI例數20 43 35 42年齡（歲）56±6.3 55±5.4 58±7.3 57±6.8男性［例（%）］12（60.0）32（74.4）22（62.9）31（73.8）TCHO（mmoL）5.2±0.5 5.3±0.3 5.6±0.8 5.7±0.7 LDL（mmoL）2.2±0.5 2.5±±0.7 2.6±0.4 2.7±0.9血糖（mmoL）5.3±0.6 5.8±0.6 5.7±0.5 5.5±0.4

圖1 正常人和CHD患者外周血CRP和CK水平檢測Fig.1 The levels of CRP and CK in normal subjects and CHD patients

2.2循環微粒分離與鑒定收集健康人和CHD患者外周血，以試劑盒結合離心法分離外周血中總的循環微粒。向分離所得的微粒懸液中加入直徑為1 μm標準珠，流式細胞術分析結果顯示，微粒粒徑與標準珠接近（圖2A），與文獻報道的微粒分布范圍（100 nm～1 μm）相吻合［6-7］。隨后，我們檢測了微粒表面特征性分子，如Annexin V和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）［8］。結果發現，分離所得的微粒表面高表達上述兩種標志分子（圖2B）。以上結果證明，本研究成功的從健康人和CHD外周血中分離得到了循環微粒。

圖2 循環微粒分離與鑒定Fig.2 The isolation and identification of circulation MPs

2.3冠心病患者循環EMPs水平及臨床意義利用流式細胞儀檢測了健康人和CHD患者循環EMPs的水平。本研究采用CD31和Annexin V作為內皮微粒的標志分子。結果發現健康人外周血循環微粒中EMP所占比例為70.02%，而SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs比例分別為78.25%、84.57%和95.36%，明顯高于健康人，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖3A、3B）。進一步分析健康人和CHD患者外周血中EMPs濃度后發現，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs濃度明顯高于健康人，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖3C）。

為了探究CHD患者外周血中升高的EMPs水平與同樣異常的CK和CRP之間的關系，進行了相關性分析。如圖3D和3E所示，SA、UA和AMI型CHD患外周血CK和CRP濃度與EMPs水平具有顯著的相關性（P＜0.01），證明CHD患者外周血EMPs水平的升高與提高的CK和CRP濃度具有密切的關系。

2.4冠心病患者外周血EMPs水平與凝血狀態之間的關系冠狀動脈內血栓是急性冠脈綜合癥發生的主要原因，而凝血和纖溶功能的異常是促進血栓形成的重要原因［9］。已有文獻報道，CHD患者的血液處于高凝狀態。因此檢測了CHD患者纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和活化部分凝血酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）以驗證CHD患者的凝血狀態。如圖4A所示，SA、UA和AMI型CHD患者FIB較正常人明顯提高，而PT和APTT明顯低于正常人，差異具有統計學意義（P＜0.05）。為了研究CHD患者外周血EMPs與血液高凝狀態之間的關系，將二者進行相關性分析。結果如圖4B所示，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs濃度與FIB呈顯著正相關（P＜0.01），而與PT和APTT呈顯著負相關（P＜0.01）。以上結果證明，CHD患者外周血中升高的EMPs可能參與CHD患者血液高凝狀態的形成。

2.5藥物治療降低CHD患者循環EMPs水平所有患者均接受阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣片的常規藥物治療方案。藥物治療2周后收集患者外周血，分離循環微粒，流式細胞術檢測CHD患者循環EMPs水平。結果發現，SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs比例分別為75.35%、78.57%和81.23%，低于治療前的EMPs水平，差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖5A、5B）。進一步分析CHD患者外周血中EMPs濃度后發現，藥物治療后，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs濃度明顯低于治療前EMPs濃度，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖5C）。

前面的結果提示，EMPs與凝血狀態密切相關。因此推測藥物治療后，患者循環EMPs水平降低，必然伴隨著凝血狀態的改變。本研究收集藥物治療后的CHD患者血液，檢測凝血狀態。結果發現，SA、UA和AMI型CHD患者FIB較治療前有明顯的下降，而PT和APTT較治療前明顯升，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖5D）。

為了進一步驗證循環EMPs與CRP和CK之間的關系，檢測了藥物治療后的CHD患者血液中的CRP和CK含量。如圖6A、6B所示，藥物治療后，CHD患者CRP和CK含量明顯低于治療前水平，差異具有統計學意義（P＜0.05）。以上結果進一步證明CHD患者外周血中升高的EMPs與CHD患者血液高凝狀態和升高的CRP和CK含量有密切的相關性。

圖3 冠心病患者循環EMPs水平及與CRP和CK之間的關系Fig.3 The level and of EMPs in CHD patients and the relationship between EMPs and CRP or CK.

3 討論

隨著人們生活水平的提高，生活方式和飲食結構發生了明顯的變化，導致CHD在發展中國家的發病率也出現了明顯增長的趨勢。世界衛生組織曾警告，到2020年，冠狀動脈疾病（冠心病）將成為全世界主要的醫療負擔［10］。近幾十年來，盡管CHD藥物治療指南的廣泛推廣以及靜脈溶栓經皮介入治療和冠脈搭橋手術日益完善和普及，CHD的治療有了更多的選擇［11-12］。然而，CHD的發病機制仍然不清楚，這給預防CHD帶來了極大的挑戰。因此研究CHD的發展機制和診斷方法和治療手段具有重要的現實意義。

目前“內皮損傷反應學說”逐漸成為CHD發病機制的主流學說。該學說認為，血管內皮功能障礙和炎癥性反應是CHD關鍵性的病理特征，即CHD患者存在血管內皮細胞損傷及炎癥激活［13-14］。內皮細胞在損傷或激活的狀態下將釋放EMPs進入血管，導致外周血中EMPs水平的升高［15-16］。因此EMPs可以在一定程度反應CHD的發生和嚴重程度［17］。本研究發現，SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs的比例和濃度均明顯大于健康人（圖3A～C）。該結果的意義在于，對于一些特殊原因造成的不宜做冠脈造影的患者，可以輔助檢查外周血EMPs水平來輔助診斷CHD。

EMPs可攜帶母體細胞的膜受體而表達相應受體表型，如 CD31、CD144、CD51、CD54、CD106、CD146、CD105、CD62E和 Annexin V等表面抗原，這些表面抗原可以作為內皮細胞損傷的標記，反映內皮功能障礙［8，17］。但不同的 EMPs表型在不同疾病狀態下表現不同的臨床意義。CD31陽性的EMPs是CHD發病中常見的標志物［8］。因此本研究采用CD31和Annexin V作為EMPs的標志分子。

圖5 藥物治療降低CHD患者循環EMPs水平Fig.5 The level of EMPs in CHD patients were decreased by drug treatment

圖6 藥物治療降低CHD患者CRP和CKFig.6 The level of CRP and CK in CHD patients were decreased by drug treatment

本研究不僅發現CHD患者循環EMP水平明顯升高，而且發現CHD患者循環EMPs水平的變化總是伴隨著CHD患者血液凝固狀態和CRP和CK含量的變化：即EMPs水平與FIB、CRP和CK呈顯著正相關，而與PT和APTT呈顯著負相關（圖3、4）。收集藥物治療后患者的外周血，檢測后發現循環EMPs水平較治療前出現明顯的下降（圖5AC）。因此推測當CHD患者接收藥物治療后，其凝血狀態和CRP以及CK水平將出現與EMPs對應的變化。因此本研究檢測了藥物治療后CHD患者的FIB、PT、APTT、CRP和CK。結果與預期結果一致，即藥物治療后，CHD患者FIB較治療前出現明顯的下調，而PT和APTT則出現明顯的上調（圖5D）；CRP和CK均比治療前出現明顯的下調（圖6A、6B）。以上結果證實，CHD循環EMPs與CHD患者凝血功能、CRP和CK含量之前存在密切的相關性，并可能參與凝血功能和CRP、CK含量的調節。

綜上所述，本研究發現CHD患者循環EMPs水平明顯高于健康人，CHD患者循環EMPs與CHD患者的高凝狀態和上調的CRP和CK含量密切相關，并可能參與調節CHD患者的凝血狀態和CRP以及CK含量，但具體的調節機制需要進一步研究來探究。