?玉米秸稈制備土壤生物修復劑及其應用效果?

摘 要：針對溫室大棚內土壤土傳病原菌多、農藥殘留量高的特性，研制出了既能生物 降解農藥殘留、又能生物防治土傳病害的生物修復劑。該菌劑以玉米秸稈為原料經水熱處理后，固體發酵制成。采用室內土壤降解試驗，在菌劑加入量5 g/kg干土、多菌靈量為100 mg/kg干土時，滅菌土壤中的多菌靈8 d被完全降解，而自然土壤中的多菌靈被完全降解縮短到6 d，說明土著微生物和降解菌共代謝降解作用明顯。另外，還做了修復劑對黃瓜枯萎病的活體防效試驗，防治效果達到81.7%，優于化學農藥。

關鍵詞：木霉;生物降解;水熱處理;多菌靈

中圖分類號：S156 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）01-0045-03

Preparation of Soil Bioremediation by Corn Stalk and its Application

TIAN Lian-sheng，CHEN Fei

（Yangzhou Polytechnic Institute， Yangzhou 225127， PRC）

Abstract：In order to solve these problems of more soil borne pathogens and and high pesticide residue in the greenhouse， a bioremediation agent was developed to the biodegradation of pesticide residue and biological control of soil-borne diseases. Using corn straw as the raw material， the agent was produced through hydrothermal treatment and solid fermentation. Adding 5 g/kg dry soil and 100 mg/kg carbendazim to it， the carbendazim in sterilized soil was degraded completely after 8 days by laboratory experiment of soil degradation where as the carbendazim in natural soil was degraded completely only after 6 days. The results showed that effect of co-metabolism and degradation of indigenous microorganisms and degrading bacteria was obvious. The control effect experiment on cucumber Fusarium wilt in vivo was conducted. The prevention effect was up to 81.7% and was more efficient than the chemistry pesticide.

Key words：Trichoderma; biodegradation; hydrothermal treatment; carbendazim

土傳病害是土壤中病原物侵染寄主植物所引起的一類植物病害。一般農作物栽培3～4 a后土傳病原菌會越來越嚴重，對農產品品質、產量及生長造成影響，可使農產品產量下降20%～40%，情況嚴重的甚至絕收。近年來隨著農業結構調整，設施農業發展迅速，溫室大棚栽培面積已達約270萬hm2。由于溫室大棚內相對濕度和溫度較高，通風環境較差，易于發生土傳病害，導致農產品農藥殘留較高、產量下降，嚴重制約了保護地栽培的可持續發展[1]。特別是近年來，我國的保護地栽培已經進入規模化生產階段，這更為植物土傳病害在溫室大棚大規模發生創造了適宜環境和滋生條件[2]。采用多點取樣的方法，在同一地塊溫室大棚內和大棚外分別采取土壤樣品，通過實驗室培養并檢測出如下結果：棚內土壤中，土傳病原菌數量是棚外3.2倍，其他微生物如細菌量減少了7.8倍，真菌量減少2倍，放線菌減少5倍，農藥殘留量卻比棚外高了約6.7倍。可見溫室大棚內土壤中病原菌大量孳生繁殖，導致其他有益微生物數量降低，嚴重破壞了土壤微生態平衡;另外，土傳病原菌的大量存在，也易引發病害頻繁發生，而農民頻繁的噴藥防治，又增加了土壤和蔬菜中的農藥殘留量，形成惡性循環。因此，降解土壤中的農藥殘留，抑制土傳病原菌成為國內外學者研究的重點[3-10]。

針對這一問題，揚州工業職業技術學院實驗室分離、選育出能分解多菌靈等氨基甲酸酯類農藥的降解菌T11和能有效抑制尖鐮孢菌（Fasariumsp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等土傳病原菌的生防菌T41，以玉米秸桿為原料，經水熱處理后，通過混菌發酵制得土壤生物修復劑，該修復劑既能有效抑制土壤中的土傳病原菌，提高有益微生物數量，修復被破壞的生態環境;又可生物降解土壤中的農藥殘留，使生產的農產品達到綠色食品標準。以期從根本上解決溫室大棚產生的作物發病率高，農產品中的農藥殘留量大導致農產品產量和品質下降的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木霉T11（Trichoderma spp.）降解菌株，實驗室在農藥廠倉庫土壤中分離、選育得到;木霉T41為實驗室篩選的高效生防菌株;50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇靖江農藥廠提供）;纖維素復合酶（NS50013）（諾維信北京公司提供）;液體培養基：麩皮浸出液100 mL，（NH4）2SO4 0.2～0.4 g，K2HPO4 0.2～0.3 g，CaCO3 1 g，補加水至1 000 mL，調pH值至6.0～6.5;固體培養基：已預處理的稈粉10 g，葡萄糖0.7 g，（NH4）2SO4 0.4 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.08 g，水30 mL，調pH值至6.0～6.5;PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。

1.2 修復劑的制備

1.2.1 水熱預處理 把玉米秸稈干燥后，通過粉碎機將秸稈粉碎、篩分，篩選出粒徑約40目的部分備用。取10 g粉碎至40目玉米秸稈粉和200 mL去離子水，分別加入催化劑FeCl3 0.1、0.6、1.1、1.6和2.1 g，混合后加入到500 mL的反應釜中，并密封反應釜。檢測不同催化劑加入量下的木質素溶出率。

（1） 第一級預處理。打開磁力攪拌和冷卻水閥門，攪拌器轉速調至250 r/min，打開電加熱裝置開始加熱。當溫度到達160℃～170℃，保持恒溫20～22 min水解玉米秸稈中的半纖維素。一級預處理結束后，物料固液分離，固體相再進行第二級處理;液項返回當做水繼續使用。

（2）第二級預處理。一級處理后的固體10 g及200 mL去離子水，加入到500 mL 的反應釜中，并密封反應釜。當溫度達到200℃時，恒溫20～25 min脫除木質素，使處理過的玉米秸稈變得疏松。預處理反應結束后，將物料固液分離，液項作為水循環使用，固體物料送至固體發酵裝置。

1.2.2 種子液制備 分別將木霉T11、T41接種在PDA培養基上，于25℃恒溫培養3 d，各挑取綠色分生孢子，接種到裝有100 mL液體培養基的三角瓶中，于200 r/min培養30～35 min，用血球計數板對孢子懸浮液計數，控制孢子濃度108 CFU/mL。

1.2.3 固體發酵 在250 mL三角瓶中放入10 g固體培養基，滅菌后以5%接種量接入1.3種子液和20 mL滅菌水，振蕩混勻后于25℃、保濕培養6 d，取樣干燥后用血球計數板測產孢量，當分生孢子量達到1.0×1010 CFU/g時即可終止發酵，固體發酵物風干后即為生物修復劑。

1.3 修復劑在滅菌土壤中的降解效果試驗

在干燥箱中，把農田土樣平鋪在盤中，在170℃干熱滅菌2 h。將100 mg多菌靈和5 g生物修復劑放到200 mL無菌水中混勻后，再與1 000 g滅菌土混勻，放入已高溫滅菌的花盆內。將盆口用五層紗布包扎好，于25℃保溫、保濕處理，定期取樣測多菌靈含量[11]。另設100 mg多菌靈、5 g固體培養基和1 000 g滅菌土混合為對照處理，重復3次。

1.4 修復劑在自然土壤中降解效果試驗

將多菌靈、修復劑和適量水混合，取折合1 000 g滅菌土的自然土混勻，按1.5方法與修復劑、多菌靈混合，調節含水量達20%。另設加入等量固體培養基、多菌靈和自然土混合為對照處理，重復3次。將盆土置于環境培養箱，在25℃、保濕放置，定期取土樣檢測多菌靈含量。

1.5 修復劑對黃瓜枯萎病防治效果試驗

試驗設3個處理：A，取修復劑5 g與2 000 g土壤混合后裝入盆內;B，取2 000 g土壤裝入盆內，用50%速克靈可濕性粉劑500倍液15 mL/株灌根;C，取2 000 g土壤裝入盆內作為對照。以上3盆分別移栽8株津青1號黃瓜苗。然后分別取15 mL尖鐮孢菌孢子懸浮液（105 CFU /mL）給黃瓜苗灌根。每處理4盆，重復3次。于25℃保濕栽培20 d，調查瓜苗發病情況，按公式（1）、（2）計算發病率和對枯萎病的防治效果。

發病率=感病株數/總株數×100% " " " " " " " " （1）

防治效果=（對照發病率-用藥發病率）/對照發病率×100% " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（2）

2 結果與分析

2.1 修復劑制備過程中催化劑用量

通過圖1可見，玉米秸稈熱水預處理過程中FeCl3對木質素的溶出有很好的催化作用，隨著FeCl3用量的增加，木質素溶出率快速提高，在1.6 g以后趨于穩定。因此，催化劑加入量以1.6 g為宜。

2.2 修復劑在滅菌土壤中對多菌靈的降解效果

修復劑處理過的土樣中，降解菌T11對多菌靈降解非常迅速，第8 d時已檢測不到多菌靈殘留，基本被完全降解。而對照土壤中多菌靈自然降解速度緩慢，處理8 d時多菌靈僅降解了12.1 mg，12 d時也只被降解了21.3 mg。表明T11是一株性能優良的降解菌株。由圖2可見：開始2 d內降解速率稍慢，降解了26.9 mg多菌靈;但在隨后2 d內降解速度加快，有45.5 mg多菌靈被降解;而第6～8 d時降解速度又變慢。這可能是降解菌分生孢子剛施入土壤，需要在土壤中定殖和繁殖，而隨著降解菌株大量繁殖，促進了多菌靈的降解速率;隨著土壤內營養成分減少，降解菌株的繁殖和代謝能力下降，降解能力也隨之減弱所致。

2.3 修復劑在自然土壤中對多菌靈的降解效果

自然土壤中的修復劑，對多菌靈降解速度比滅菌土壤快很多。處理6 d就可使多菌靈完全降解，比滅菌土完全降解縮短了2 d。而對照自然土壤中對多菌靈降解效果也比滅菌土快，處理12 d時，可降解多菌靈50.2 mg，而在滅菌土對照中12 d降解多菌靈只有21.3 mg。結果表明：無論是放入修復劑的處理，還是空白對照中，修復劑在自然土壤中對多菌靈降解效果均好于滅菌土處理。這可能是因為自然土壤中的土著微生物和降解菌共代謝降解作用，提高了對多菌靈的降解速率，縮短了降解時間。

2.4 修復劑對黃瓜枯萎病的防治效果

經過15 d盆栽防效試驗，生物修復劑和50%速克靈可濕性粉劑500倍液對黃瓜枯萎病的防治效果統計見表1。由表1可見：修復劑對黃瓜枯萎病防效達到81.7%，優于速克靈的防治效果78.4%，且差異顯著。另外，處理15 d后田間觀察：修復劑處理的瓜秧粗大（平均株高高了1.2 cm），葉片深氯、肥大，表明修復劑對植物有一定的促生長作用。

3 結 論

（1） 加入1.6 g催化劑FeCl3，經過二級水熱預處理，能有效水解玉米秸稈中的半纖維素，降解少量木質素，破壞纖維素的結晶結構，從而提高玉米秸稈中纖維素的利用率。

（2）通過降解菌和生防菌混菌發酵，可制得分生孢子量達到1.0×1010 CFU/g的生物修復劑。

（3）生物修復劑在自然土壤中對多菌靈的降解效果優于滅菌土，處理6 d就可使多菌靈完全降解，比滅菌土完全降解縮短了2 d。

（4）修復劑對黃瓜枯萎病防效達81.7%，優于速克靈的78.4%防治效果，且差異顯著。

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