?在線凈化液相色譜高分辨質譜聯用測定茶葉中5種氨基甲酸酯類農藥殘留?

摘 要：運用在線凈化液相色譜高分辨質譜聯用技術，測定茶葉中5種氨基甲酸酯類農藥殘留。樣品采用0.1%乙酸乙腈提取、離心后，提取液經在線凈化柱（Cyclone P）凈化，以10 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液將待測物洗脫至C18柱上，用液相色譜+高分辨質譜檢測。結果表明：5種氨基甲酸酯類農藥在5～100 ng/mL濃度范圍內有良好的線性關系，在茶葉中的加標回收率為86.7%～103.2%，相對標準偏差為2.5%～9.6%。該方法簡單、快速、靈敏、準確、穩定，適用于茶葉中5種氨基甲酸酯類農藥殘留的測定。

關鍵詞：在線凈化;液相色譜;高分辨質譜;氨基甲酸酯類農藥;茶葉

中圖分類號：O658 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）01-0086-03

Determination of 5 Carbamate Pesticide Residues in Tea by On-Line Cleanup Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry

DU Yan-yu，YING Xue-yan，ZHANG Yu，LUO Yi-lian，WU Dong-mei，ZHAI Yun-zhong，WANG Jie-qiong

（The Agriculture Beast and Fishing Product Quality Supervision Inspection and Test Center of Changzhou， Changzhou 213002， PRC）

Abstract：A method was established for determination of 5 carbamate pesticide residues in tea by on-line cleanup liquid chromatography high resolution mass spectrometry. The samples were extracted and centrifuged with acetonitrile. The extract was purified by online column （Cyclone P）， and then the target compound was eluted to C18 column with 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile solution for further detection by liquid chromatography high resolution mass spectrometry. The results showed that the method has a good linearity concentration range from 5 ng/mL to 100 ng/mL， average recoveries of the analyses in tea ranged from 86.7% to 103.3%， and the relative standard deviation values are 2.5%-9.6%. The method is simple and rapid， reagent-saving and with high recoveries， sensitivity and good reproducibility， therefore it is suitable for determination of carbamate pesticide residues in tea.

Key words：online cleanup; liquid chromatography; high resolution mass spectrometry; carbamate pesticide; tea

氨基甲酸酯類農藥是繼有機氯和有機磷農藥后發展起來一種新型廣譜殺蟲、殺螨、除草劑，具有殘留期短、易分解、效率高、選擇性強等優點[1-2]，廣泛應用于蔬菜、水果、糧油等作物，近年來在茶葉中的使用量和檢出率逐年增加[3-6]。調查發現，氨基甲酸酯類農藥的使用量已超過有機磷農藥，其在作物中的殘留以及對人類健康和環境造成的危害也越來越受到人們的關注。衛生部食品污染源調查項目已要求對茶葉中氨基甲酸酯類化合物污染情況進行檢測。

目前，氨基甲酸酯類農藥檢測方法主要有酶聯免疫法、氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣質聯

用法（GC-MS-MS）和液質聯用法（HPLC-MS-MS）[7-11]。在線凈化是針對質譜分析的高級在線復雜基質樣品萃取技術，高分辨質譜儀提供更精確分子量、更高質量分辨率的全掃描數據，特異性及抗干擾能力強，越來越多地應用于農獸藥殘留檢測領域[12-13]。研究通過優化工藝參數，建立了基于在線凈化液相色譜-四極桿/

靜電場軌道阱高分辨質譜儀的茶葉氨基甲酸酯類農藥殘留檢測方法，結果顯示，該方法操作簡便快速、結果準確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉樣品：安吉白茶一號，采自溧陽市天目湖玉枝茶果園藝場，2017年4月生產，一芽2葉，粉碎備用。5種氨基甲酸酯類農藥標準物質：克百威、涕滅威、甲萘威、滅多威、抗蚜威標準溶液（濃度1 000 mg/L，農業部環境保護科研監測所）;甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）、乙酸、乙酸銨（色譜純，國產）;試驗用水為超純水。

Turboflow在線凈化液相色譜-Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國ThermoFisher公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;5804R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;渦旋混合器（德國IKA公司）;純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取5.00 g（精確至0.01 g）茶葉樣品于50 mL塑料離心管中，分別加入10 mL 甲醇、乙腈、0.1%乙酸乙腈、丙酮4種提取液，于渦旋混合器上渦旋5 min，7 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液過0.22 μm濾膜，觀察濾液的外觀并上機測定，選擇最佳的提取溶劑。

1.2.2 在線凈化條件的優化 在線凈化系統包含2個四元泵（Loading泵和Eluting泵）和2個六通閥，Loading泵控制在線凈化流路，Eluting泵控制液相分析流路;六通閥控制兩個流路的分離和合并。選用苯基柱、C18柱、反相混合基質的Cyclone-P 柱（規格均為0.5 mm×50 mm）3種凈化柱，通過凈化效果確定在線凈化柱類型;上樣溶劑（A）：10 mmol/L乙酸銨溶液;洗脫溶劑（B）：將10 mmol/L乙酸銨溶液與乙腈按不同比例（10︰90、15︰85、20︰80、25︰75和30︰60）配比來洗脫目標化合物，通過洗脫效果確定洗脫劑成分的最適比例;清洗溶劑（C）：乙腈/異丙醇/丙酮（體積比1︰1︰1），洗脫流速：2.0 mL/min，進樣體積：50 μL。在線凈化和梯度洗脫程序見表1。

1.2.3 液相色譜條件的優化 色譜柱為Hypersil GOLD

（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。選擇純水、5 mmol/L乙酸銨溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液分別為無機相（A），乙腈、甲醇分別為有機相（B），通過目標化合物出峰峰型、響應值和各組分分離情況確定最佳流動相組成。

1.2.4 質譜條件 采用HESI離子化方式，溫度300℃;噴霧電壓3.2 kV;毛細管溫度350℃;鞘氣35 unit，輔助氣15 unit;全掃描模式，t-MS2掃描，采集范圍100～1 100 m/z，正負離子同時采集掃描;分辨率R=70 000;碰撞能量NCE=35 eV。

1.2.5 方法特性研究 （1）檢出限。采用茶葉空白基質液，添加一定濃度混標溶液配制標準工作液上機測定，以目標化合物在空白茶葉樣品中3倍信噪比計算檢出限。（2）線性范圍。采用茶葉空白基質液，添加不同濃度混標溶液配制標準工作液，在最佳儀器條件下上機測定，確定線性范圍。（3）添加回收率試驗。選用不含5種氨基甲酸酯類農藥的空白茶葉樣品，添加混標工作液，在10.0、50.0、100.0 μg/kg這3個濃度水平按該方法確定的最佳試驗參數進行測定，得出含量后計算回收率。（4）精密度。在添加回收率試驗同時，每個濃度水平進行6次重復測定，計算精密度。

2 結果與分析

2.1 樣品提取優化

茶葉樣品基質復雜，試驗結果表明，丙酮提取的溶液顏色較深、雜質較多，質譜基質影響明顯;甲醇、乙腈、0.1%乙酸乙腈提取的溶液顏色較淺，基質影響小，0.1%乙酸乙腈提取的回收率略高于甲醇和乙腈，因此后續試驗中采用0.1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 最佳在線凈化條件

在線凈化過程主要包括上樣、轉移洗脫和淋洗3個階段。試驗結果表明，Cyclone-P柱對試驗選取的5種化合物均能有效保留并較易被洗脫，其他凈化柱保留強不易被洗脫，色譜峰型較差。因此，以Cyclone-P 柱作為該試驗的在線凈化柱。選用10 mmol/L乙酸銨溶液為上樣溶液，5種化合物均能有效保留，且在洗脫轉移時能被完全洗脫。洗脫劑以10 mmol/L乙酸銨溶液︰乙腈=25︰75（體積比）的效果最好，能使化合物較好地完成洗脫，同時峰型和分離度均滿足要求。

2.3 最優液相色譜條件

液相色譜條件的關鍵是Eluting泵的流路組成和配比，在線凈化柱流出的待測物由在線凈化洗脫液和HPLC流動相帶入液相分析柱，進行分離檢測，在線凈化洗脫液和HPLC流動相的初始比例對目標化合物的峰型和分離影響較大，為了減小有機溶劑效應，轉移洗脫采用低Loading泵流速（0.06 mL/min）和高Eluting泵流速（0.34 mL/min），使得進入液相柱的有機相乙腈比例進一步減少。結果表明：5 mmol/L乙酸銨溶液+乙腈作流動相，能使5種目標化合物均獲得較好峰型和較高的響應。

2.4 5種化合物的質譜參數

采用高分辨一級質譜全掃描正負離子同時掃描的模式對5種化合物進行檢測，發現5種化合物均在正離子模式下有響應，均產生[M+H]+峰。選擇70 000分辨率，可以使目標化合物與干擾物質完全分離，達到良好的定性定量效果。再利用t-MS2掃描模式，以保留時間、母離子精確質量數及一個碎片離子的精確質量數定性，以豐度最高的碎片離子進行定量。5種化合物的質譜參數見表2。

2.5 檢出限與線性范圍

測定濃度范圍為5～100 ng/mL的標準工作液，繪制標準工作曲線。結果表明：在5～100 ng/mL濃度范圍內各組分均呈良好的線性，線性方程及相關參數見表3?？税偻?、滅多威、涕滅威、甲萘威和抗蚜威的檢出限分別為0.6、1.0、0.3、0.3和0.1 μg/kg。茶葉空白基質中添加5種混標的離子色譜圖見圖1。

2.6 添加回收率和精密度

由表4可知，5種待測化合物的回收率都在86.7%～103.2%之間，相對標準偏差均≤9.6%。這表明優化后的檢測方法表現穩定，重現性良好。

3 結 論

采用先進的在線凈化技術，結合高分辨質譜檢測，建立了在線凈化液相色譜高分辨質譜串聯技術測定茶葉中5種氨基甲酸酯類農藥殘留的方法。該方法前處理簡單，可最大程度地減少人為干擾因素，實現快速準確定性和定量測定。同時，該方法的添加回收率為86.7%～103.2%，相對標準偏差≤9.6%，表現穩定，重現性良好，方法檢出限為0.1～1.0 μg/kg，能滿足實際茶葉樣品中5種氨基甲酸酯類農藥殘留的日常檢測要求。

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