沙田柚PIF5基因的鑒定及序列分析

摘 要：對(duì)沙田柚的PIF5轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行鑒定和序列分析。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)2 323 bp（GenBank登錄號(hào)：MH020222），含有1 512 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），共編碼503個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為54.95 kDa，等電點(diǎn)PI為5.12。該蛋白質(zhì)含有一個(gè)PP2Cc 保守結(jié)構(gòu)域，為親水性穩(wěn)定蛋白。氨基酸序列分析表明，該氨基酸序列與克萊門柚（Citrus clementina）

和甜橙（Citrus sinensis）相似性很高，相似度分別達(dá)到100%和99%。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)沙田柚的PIF5轉(zhuǎn)錄因子基因與克萊門柚和甜橙親緣關(guān)系很近，屬于同一分支。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明：PIF5基因在沙田柚在未授粉花柱中的表達(dá)量（RPKM）為2.94，自花授粉1、2、3 d花柱中的表達(dá)量（RPKM）分別為4.35、3.74、3.99，在異花授粉1、2、3 d花柱中基因的表達(dá)量（RPKM）則分別為3.39、1.70和0.98。

關(guān)鍵詞：沙田柚；PIF5基因；自交不親和；序列分析；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）06-0001-04

Identification and Sequence Analysis of PIF5 Gene from Citrus grandis var. Shatinyu Hort

XU Yuan，CHEN Yu-mei，CHEN Jin-ling，LI Lu-lu，LI Hui-min，QIN Xin-min

（College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin 541001， PRC）

Abstract： Phytochrome Interacting Factor 5 （PIF5） gene of Citrus grandis var. Shatinyu Hort was identified and sequence analyzed. The results of analysis showed that the PIF5 gene is 2323bp （GenBank accession number： MH020222） in length with an open reading frame （ORF） of 1 512 bp， encoding 503amino acids with deduced molecular of 54.95 kDa， theoretical pI value of 5.12， and contained a PP2Cc superfamily conserved domain. Bioinformatics analysis showed that PIF5 protein was a hydrophilic and stable protein. The homology analysis of amino acid sequence indicated that the PIF5 protein shared high homology with that of Citrus clementina （100%） and Citrus sinensis （99%）. Phylogenetic analysis revealed that PIF5 gene showed closer kinship with Citrus clementina and Citrus sinensis， indicating that they belong to the same evolutionary branch. The results of transcriptome sequencing showed that expression of PIF5 gene was 2.84 in unfertilized style， and the expression of the gene were 4.35， 3.74 and 3.99 in 1-3 day self-pollinated styles. Whereas， the expression of PIF5 gene were 3.39， 1.70 and 0.98 in 1-3 day cross -pollinated styles respectively.

Key words： Citrus grandis var. Shatinyu Hort； PIF5； self-incompatibility； sequence analysis； expression of gene

自交不親和是植物界普遍存在的一種現(xiàn)象，是控制植物受精的主要方式[1]。近年來(lái)，植物自交不親和特性已被用于作物制種、育種和果樹(shù)的品質(zhì)改良，成為利用雜種優(yōu)勢(shì)的有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)參與植物自交不親和機(jī)制的除了S基因座之外還涉及到許多其他與S基因座連鎖的非S基因座基因，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)

程[2]。如罌粟科植物的自交不親和過(guò)程，除了受到S決定因子PrpS和PrsS的調(diào)控外，還與花粉管內(nèi)的Ca2+濃度、花粉蛋白P26、蛋白激酶p56及PrABP8蛋白等有關(guān)，它們通過(guò)Ca2+濃度變化、細(xì)胞程序性死亡和F肌動(dòng)蛋白解聚，使花粉管停止生長(zhǎng)[3-6]。目前，薔薇科、茄科、玄參科、罌粟科和十字花科等植物的自交不親和機(jī)理已基本明確。沙田柚（Citrus grandis var. Shatinyu Hort）屬蕓香科柑橘屬植物，為典型的配子體自交不親和果樹(shù)，其自交不親和的分子機(jī)理目前尚不清楚。

光敏色素相互作用因子（Phytochrome Interacting Factors，PIFs）屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族的第15亞族。研究表明，該家族成員主要通過(guò)介導(dǎo)光信號(hào)途徑調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[7]。PIFs參與植物的多種生物學(xué)過(guò)程，如種子萌發(fā)，光形態(tài)發(fā)生，遮蔭反應(yīng)，開(kāi)花時(shí)間和葉片衰老等[8-10]。PIF5轉(zhuǎn)錄因子作為PIFs家族成員之一，其C端是保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，N末端具有保守的活性光敏色素B結(jié)合結(jié)構(gòu)域（APB），能與光敏色素B的遠(yuǎn)紅光吸收型prf形式結(jié)合[11-12]。PIF蛋白在結(jié)構(gòu)上含有相同和互不相同的DNA結(jié)合特性，因此在功能上表現(xiàn)出重疊及各自特定功能[13]。已有研究表明，PIF5轉(zhuǎn)錄因子能特異性的調(diào)控乙烯生物合成，并且能與其家族成員協(xié)作，在調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生、避蔭反應(yīng)、胚胎發(fā)育及葉綠素合成等方面發(fā)揮重要作用[14-16] 。

目前，尚未見(jiàn)PIF5轉(zhuǎn)錄因子基因與沙田柚自交不親和性相關(guān)的研究報(bào)道。因此，研究在對(duì)沙田柚自交和異交花柱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，獲得了沙田柚PIF5基因，并對(duì)該基因在未授粉、自花授粉與異花授粉1～3 d花柱中的表達(dá)以及其編碼蛋白質(zhì)的理化特征進(jìn)行分析，旨在為深入研究PIFs基因的功能和沙田柚自交不親和的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為沙田柚未授粉、自花授粉與異花授粉的花柱，采集與處理方法按文獻(xiàn)[17]報(bào)道進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花柱RNA的提取、建庫(kù)和測(cè)序 沙田柚花柱總RNA的提取參照改良Trizol法[18]進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄組的建庫(kù)和測(cè)序參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 基因序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建 PIF5基因序列和編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析分別采用DNAMAN、NetPhos 3.1 Server、SOPMA等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙田柚PIF5基因序列分析

沙田柚PIF5（CL137.Contig3_All）基因序列全長(zhǎng)為2 323 bp（GenBank登錄號(hào)為MH020222），利用生物信息學(xué)軟件DNAMan以及NCBI上的ORF Finder對(duì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該序列含有一個(gè)1 512 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼503個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 沙田柚PIF5基因編碼蛋白質(zhì)的分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 對(duì)PIF5基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)（http：//web.expasy. Org /protparam/）。結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2402H3800N668O769S19，分子質(zhì)量為54.95 kDa，等電點(diǎn)PI為5.12。構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸中，蘇氨酸（Ser）所占比例最大，為10.3%，酪氨酸所占比例最少，僅為1.2%。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為37.91（<40），屬于穩(wěn)定蛋白。其中，該蛋白質(zhì)所含的負(fù)電荷氨基酸（Asp + Glu）和正電荷氨基酸（Arg + Lys）總數(shù)分別為74和57。該蛋白質(zhì)的疏水性經(jīng)DNAMAN軟件分析，其肽鏈中疏水性最大值約為1.611，位于第55位氨基酸，最小值約為-3.333，位于第40、41、42、43位氨基酸。該蛋白質(zhì)疏水性平均值為-0.338，鑒定該蛋白質(zhì)為親水性蛋白（圖2）。

2.2.2 跨膜預(yù)測(cè) 運(yùn)用跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子PIF5的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白不屬于跨膜蛋白，結(jié)果預(yù)測(cè)如圖3所示。

2.2.3 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)采用在線預(yù)測(cè)軟件NetPhos3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，PIF5基因編碼的蛋白質(zhì)，共有60個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)共有42個(gè)，分別位于蛋白質(zhì)的第3、11、12、25、31、41、42、90、92、117、124等位點(diǎn)；蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)共15個(gè)，分別位于蛋白質(zhì)的第15、133、142、147、159、162、206、312、365、393、394、407、412、444和465位；酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)僅3個(gè)，分別為蛋白質(zhì)的第70、307和363位。由此可知，該蛋白質(zhì)的磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，其次為蘇氨酸和酪氨酸磷酸化。

2.2.4 功能結(jié)構(gòu)域分析 采用Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi）對(duì)沙田柚PIF5編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)與PP2Cc superfamily蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，屬于PP2Cc超家族，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 沙田柚PIF5編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html） 預(yù)測(cè)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占比例為33.00%，延伸鏈24.06%，無(wú)規(guī)則卷曲33.06%，β轉(zhuǎn)角占9.34%，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。運(yùn)用軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子PIF5氨基酸序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

2.3 沙田柚PIF5基因編碼蛋白質(zhì)的同源性分析

沙田柚 PIF5基因的氨基酸序列與其他10種植物PIFs基因編碼的氨基酸序列同源性分析的結(jié)果表明，沙田柚PIF5基因編碼的氨基酸與克萊門柚（Citrus clementina，XP_006452792.1）和甜橙（Citrus sinensis XP_006474744.1）PIFs蛋白的相似度分別為100%和99%。此外，DNAMan 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也表明，沙田柚PIF5基因編碼的蛋白質(zhì)與克萊門柚和甜橙有很近的親緣關(guān)系，屬于同一個(gè)進(jìn)化分支（圖7）。

2.4 沙田柚PIF5基因在未授粉、自交授粉與異交授粉花柱之間的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明，該研究克隆的PIF5基因在沙田柚未授粉、自交授粉與異交授粉花柱之間的表達(dá)差異達(dá)到顯著水平。未授粉花柱中的表達(dá)量（Reads Per Kb per Million reads，RPKM）為2.94；在自交授粉1 d花柱中PIF5的表達(dá)量迅速升高，為4.35，自交2 d花柱中其表達(dá)量降低，為3.47，自交3 d花柱中其表達(dá)量開(kāi)始回升，為3.99；在異花授粉過(guò)程中，除1 d花柱中PIF5的表達(dá)量稍有升高（3.39）外，2～3 d花柱中該基因的表達(dá)量迅速降低，分別為1.70和0.98，且明顯低于自花授粉花柱。自交1～3 d花柱中PIF5基因的高表達(dá)影響了赤霉素的合成，使得花柱中赤霉素含量降低，而在異交花柱中PIF5表達(dá)量的下降，有利于花柱中赤霉素含量的升高，對(duì)花柱的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

氨基酸序列同源性分析表明，試驗(yàn)所克隆的沙田柚基因（CL137.Contig3_All）編碼蛋白質(zhì)含有一個(gè)PP2Cc保守結(jié)構(gòu)域，與蕓香科的甜橙和克萊門柚的PIFs基因同源性分別為100%和99%，屬于PP2Cc超家族基因。

近年來(lái)的一些研究表明，PIFs家族除了在光和溫度介導(dǎo)的環(huán)境信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用外，還參與了植物內(nèi)源信號(hào)的傳遞[19]。如擬南芥的PIF1/PIL5可以抑制赤霉素生物合成中關(guān)鍵基因GA3ox1和GA3ox2的表達(dá)，同時(shí)可以促進(jìn)赤霉素分解代謝基因GA2ox2的表達(dá)[20]，降低植物體內(nèi)赤霉素水平。而赤霉素能夠調(diào)控花粉的形成以及花的發(fā)育[21]。沙田柚花柱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明，PIF5基因自交2 d/異交2 d花柱、自交3 d/異交3d花柱的log2（RPKM ratio）分別為1.03和2.03，表明該基因在沙田柚自花與異花授粉2～3 d時(shí)出現(xiàn)了差異表達(dá)。但在沙田柚自交不親和反應(yīng)中該基因的功能尚不清楚。

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（責(zé)任編輯：成 平）