HPLC—MS/MS法同時測定蔬菜中38種農藥殘留

摘 要：利用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）技術，建立了蔬菜中38種農藥殘留的檢測方法。樣品以乙腈為提取溶劑，高速勻漿提取，氯化鈉脫水，高速離心分層，提取液經氨基固相萃取小柱凈化，利用HPLC-MS/MS進行測定。結果表明：38種農藥在一定質量濃度范圍內線性良好，相關系數為0.975～0.999；其中，豇豆和辣椒樣品在0.01 mg/kg添加水平下回收率分別為72.6%～119.6%和76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下回收率分別為71.5%～119.4%和75.5%～119.2%，相對標準偏差均在10%以內；該方法的定量下限為0.002 mg/kg。經驗證，該方法具有靈敏度高、選擇性好、回收率高且穩定等優點，用于實際蔬菜樣品中農藥殘留的測定，結果較為滿意。

關鍵詞：蔬菜；農殘檢測；高效液相色譜串聯質譜

中圖分類號：O657.63 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）06-0091-05

Simultaneous Determination of 38 Pesticide Residues in Vegetables by HPLC-MS/MS Method

ZHANG Wei-jun

（Liuyang Agricultural Product Quality Monitoring Center， Changsha 410300， PRC）

Abstract： Thirty and eight pesticide residues in vegetables were detected simultaneously by Hplc-MS/MS. Using acetonitrile as extraction solvent， the sample was first extracted with high speed homogenate， then dehydrated with NaCl and stratified by high speed centrifugation， the extraction liquid was purified by amino-solid extraction column and determinate by HPLC-MS /MS. The results showed that 38 kings of pesticides have good linearity within a certain mass concentration range， and the correlation coefficient is 0.975-0.999. The recovery rates of cowpea and pepper samples were 72.6%-119.6% and 76.5%-118.2% respectively， at the addition level of 0.01 mg/kg； the recovery rates were 71.5%-119.4% and 75.5%-119.2% respectively， at the addition level of 0.10 mg /kg. The relative standard deviation was within 10%. The quantitative lower limit of this method is 0.002 mg/kg. In conclusion， HPLC-MS/MS has the advantages of high sensitivity， good selectivity， high recovery and stability， and can be used for determination of pesticide residues in real vegetable samples.

Key words： vegetable； detection of pesticide residue； HPLC-MS/MS

蔬菜是人們日常生活中必不可少食物之一，為了縮短蔬菜的生長期、提高產量并減少病蟲害的影響，各類化肥和農藥廣泛使用，對蔬菜造成不同程度的污染。近年來，隨著各國對食品安全問題的重視，蔬菜中的農藥殘留檢測要求越來越嚴格，我國農業部對蔬菜農藥殘留例行監測的種類多達58種[1-5]。要完成這58種農藥殘留檢測，按照傳統色譜技術至少需要氣相色譜儀和液相色譜儀，并且配置4個不同的檢測器。近年來，色譜-質譜聯用技術作為多農藥殘留的檢測手段越來越受到人們的青睞。尤其是HPLC-MS/MS技術，HPLC可以實現多種農藥快速分離，串聯質譜可以對目標農藥準確定性，并提高檢測靈敏度，三重四級桿質譜檢測器在多反應監測模式（MRM）下具有更好的檢測靈敏度和選擇性，大大降低了假陽性分析結果的概率，非常適合蔬菜中低含量多農藥殘留物的分析[6-9]。豇豆和辣椒是湖南省種植較多的蔬菜品種，也是農藥使用量較大、容易出現農藥殘留超標的蔬菜品種，筆者以辣椒、豇豆等10種蔬菜為研究樣品，建立了甲胺磷、乙酰甲胺磷等38 種農藥的HPLC-MS/MS 檢測方法，對儀器條件、前處理方法進行了比較研究。結果表明該方法準確可靠，可用于蔬菜農藥的快速檢測分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗主要儀器有高效液相色譜—三重四級桿串聯質譜儀（e2695-TQD，ESI源） 和 XBridgeBEH C18柱[100 mm × 2.1 mm×2.7μm，美國Waters公司）、氮吹儀（美國 Organomation公司）、均質機（T18，德國 IKA 公司）、超純水純化系統（milli-Q reference，Millipore公司）、C18氨基固相萃取柱（3 cc，500 mg， 美國waters公司）、針式過濾器（0.22 μm，PTFE，天津德祥）、高速離心機（湖南湘儀）、攪拌器（珠海飛利蒲電器公司）、旋轉蒸發儀（上海申生儀器廠）。

試驗主要試劑有甲醇、乙腈、甲苯（色譜純，Merck公司）；超純水；甲酸（96%）、 乙酸銨（均為德國CNW公司產品）；氯化鈉（分析純，140 ℃烘干4 h）。38種農藥標準品（中國農業部環境監測所）。

待測蔬菜樣品來源于5家蔬菜生產單位，采集了黃瓜、普通白菜、番茄、茄子、辣椒、結球白菜、萵筍、葉芥菜、菜薹、甘薯葉等10種蔬菜樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 （1）標準儲備液：準確量取各標準溶液0.5 mL于 50 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑配成10 mg/L的混合標準儲備溶液，冷藏避光保存。（2）標準工作液的配制：分別按量量取標準儲備液，用空白基質液（V甲醇∶V水=2∶8）稀釋，得到系列標準混合工作液，質量濃度分別為 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，外標法定量。

1.2.2 待測蔬菜樣品的前處理 （1）提取：將蔬菜可食部分用攪拌機打碎，取15.00 g（精確至0.01g）于100 mL聚四氟乙烯離心管中，加入30 mL乙腈，高速勻漿1 min；采用無水硫酸鈉和氯化鈉作為脫水劑，用量均為5 g，比較二者的脫水效果再確定最適脫水劑；繼續高速勻漿1 min，4 000 r/min高速離心4 min，取上清液待凈化。（2）凈化：比較了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱對豇豆基質的凈化效果，具體操作如下，用6.0 mL淋洗劑（V乙腈∶V甲苯

=3∶1）預淋洗，待固相萃取小柱平衡好后置于10 mL 雞心瓶上，加入1 mL提取液，當提取液完全降至填料面時加入3 mL淋洗劑進行洗脫，收集洗脫液，在4 0℃水浴下減壓旋轉蒸發濃縮至約0.2 mL，再轉為40℃氮氣吹干，立即用1.0 mL 甲醇溶液（V甲醇∶V水

=2∶8）溶解定容， 過0.22 μm濾膜，待HPLC- MS /MS測定。

1.2.3 HPLC 檢測條件 試驗采用乙腈+水、甲醇+水和甲醇+水+10 mmol乙酸銨+1%甲酸水溶液3種流動相對目標化合物進行分離，色譜柱為XBridgeBEH C18柱，試液定容溶劑為V甲醇︰V水=2︰8溶劑體系，進樣體積5 μL。

1.2.4 質譜檢測條件 采用直接進樣的方式手動調節各質譜參數。離子源為電噴霧離子（ESI）源，溫度120℃；毛細管電壓3.0 kV；去溶劑溫度350℃；去溶劑氣流量750 L/h；錐孔氣流速100 L/h；錐孔電壓30 V；采用MRM多反應離子監測模式；其余質譜條件見

表1。

1.2.5 檢測方法的驗證及蔬菜樣品的檢測 將質量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合標準基質溶液進樣分析，以各組分的進樣質量濃度（x，μg/L） 和峰面積（Y） 繪制標準曲線。在優化的HPLC-MS/MS條件下，對38種農藥的線性范圍、定量下線進行檢測。并在豇豆和辣椒樣品中添加0.01和0.10 mg/kg的各種農藥，上樣檢測，計算添加回收率（n=3），并驗證檢測方法的精密度。采用試驗建立的方法對蔬菜樣品進行處理和檢測。

2 結果與分析

2.1 樣品提取優化

2.1.1 脫水劑 蔬菜含水量普遍偏高，38種農藥中有多種水溶性強的農藥。無水硫酸鈉通過與水結合的方式脫水，易受潮變性。試驗結果表明，采用無水硫酸鈉脫水，常出現甲胺磷和乙酰甲胺磷等水溶性強的農藥回收率低、乙腈提取液脫水不完全、過氨基固相萃取柱堵塞等現象；而氯化鈉是以飽和溶解方式脫水，其作為脫水劑時不會出現上述現象。故最終選擇氯化鈉作為脫水劑。

2.1.2 凈化柱 直接往預淋洗好的固相萃取柱添加標準工作液，比較了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱的對38種農藥的濾過性，結果如圖1所示。雖然Carbon/NH2凈化效果最好，但對多種農藥吸附較強，故最終確定采用C18氨基固相萃取柱作凈化柱，淋洗液為乙腈和甲苯的混合液（V乙腈∶V甲苯 =3∶1）。

2.2 流動相優化

試驗結果顯示，以甲醇為有機相時，各組分的信號強度比較穩定；而以乙腈為有機相時信號明顯降低，且強極性農藥如甲胺磷的保留時間過短，峰形較差；故甲醇為流動有機相更合適。而在甲醇+水的流動相中加入一定量的乙酸銨和甲酸等緩沖鹽各成分的分離效果更好。這是因為甲酸對氨基甲酸酯類農藥的正離子化有增強效果，而乙酸銨對負離子化有增強效果，而且會明顯抑制部分農藥的正離子化。多菌靈保留時間受pH值影響較大，pH值越小，保留時間越短。為確保38種農藥在質譜上都有較好的響應，試驗最終采用甲醇+水+10 mmol乙酸銨+1%甲酸水溶液作為流動相進行三元梯度洗脫分離，流動相參數見表2。雖然降低了部分有較高正離子化的農藥的響應值，但確保了所有農藥均有較好的離子化，同時保證了多菌靈等保留時間易受基質pH值影響的農藥的穩定性。

2.3 方法的線性范圍與定量下限、回收率與精密度

如表3所示，在優化的HPLC-MS/MS條件下，38種農藥標準溶液在上述質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2為0.975～0.999。按照S/N≥10的標準，該方法對38種農藥的最低檢測限均為0.002 mg/kg，滿足GB2763—2016中最大殘留限量要求。在豇豆和辣椒中分別添加0.01和0.10 mg/kg的各種農藥，豇豆在0.01 mg/kg添加水平下的回收率為72.6%～119.6%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率為71.5%～119.4%；辣椒在0.01 mg/kg添加水平下的回收率為76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率為75.5%～119.2%；RSD均在10%以內。

2.4 蔬菜樣品的檢測

從表4中可以看出，以結球白菜和萵筍為例，在1 kg結球白菜樣品中含吡蟲啉0.1mg，符合GB/J2763的限量標準，屬于合格蔬菜；而1 kg萵筍樣品中檢出克百威含量為0.050 mg，超出了GB/J2763中規定的限量標準（0.02 mg），屬于農殘超標蔬菜。

3 結論與討論

傳統HPLC檢測器一般搭配UV檢測器或者FLR檢測器，檢測器流通量大，對流動相流速兼容性高，因此一般HPLC使用直徑較大、填料顆粒粒徑加大的色譜柱。但是當HPLC使用質譜做檢測器時，由于離子源采用ESI源，最適液相流速不能高于0.8 mL/min。當使用0.8 mL/min流速，在傳統液相色譜柱下，檢測各農藥化合物峰底寬均超過1 min，且質譜受高流速液相影響，離子化效率降低，儀器靈敏度降低。試驗采用XBridgeBEH C18柱作色譜柱，在0.25 mL/min流速下，依然有較好的柱效和分析時間。但由于溶劑效應，試液采用甲醇為溶劑時，極性強的農藥（如甲胺磷、乙酰甲胺磷、涕滅威砜等）保留時間過短，峰形差，易受基質干擾。為消除溶劑效應，試驗選擇甲醇和水作為定容溶劑體系，V甲醇︰V水=2︰8，進樣體積從10 μL降至5 μL。

在選擇質譜條件參數時，為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，采用直接進樣的方式 手動調節各質譜參數。結果顯示，大部分農藥電噴霧離子化正離子掃描模式可得到較好的電離效果，并獲得特征離子峰[M+H]或[M+Na]，少部分為[M-H]。故在此基礎上進一步選擇質譜參數合適的監測離子錐孔電壓及碰撞能量。

研究從農業部蔬菜農藥殘留例行監測參數出發，結合本地蔬菜生菜實際情況，選取了38種農藥殘留做為研究對象，以豇豆和辣椒為試驗樣本，采用高效液相串聯三重四級桿質譜（HPLC-MS/MS）作為檢測設備，建立的較國標方法（GB/T20769—2008）更為簡便的前處理方法，精簡了一次預濃縮操作，優化了脫水劑的種類。試驗結果證明該方法準確可靠，能夠滿足蔬菜中多種農藥殘留的檢測分析。

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（責任編輯：成 平）