一株辣椒內(nèi)生拮抗放線菌的篩選及初步鑒定

摘 要：為篩選防治辣椒土傳病害的優(yōu)良生防菌種資源，從多年連作重茬的辣椒健康植株根系內(nèi)分離到一株內(nèi)生拮抗放線菌PES-A23。研究結(jié)果表明：該菌株抗菌譜較廣，對辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌、辣椒鐮刀枯萎病菌、油菜菌核病菌、香梨腐爛病菌、水稻稻瘟菌、白色假絲酵母、金黃色葡萄球菌均具有顯著抑制效果，通過16s rDNA測序、進化樹分析初步鑒定為鯉鏈霉菌（Streptomyces carpaticus）。

關(guān)鍵詞：辣椒；土傳病害；內(nèi)生生防菌；初步鑒定；鏈霉菌

中圖分類號：Q939.96 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）09-0006-03

Screening and Primary Identification of an Endophytic Antagonistic

Actinomycetes from Pepper

HUANG Jun，ZENGYan，CAI Chang-ping，BI Shi-yu，HUANG Bin-bin，GUO Zhao-hui，LIU Qing-shu

（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

Abstract： An endophytic antagonistic actinomycete PES-A23 was isolated from the roots of healthy pepper plants with continuous cropping for many years in order to screen excellent biocontrol bacteria resources for pepper soil-borne diseases. The results showed that the strain had a wide antibacterial spectrum and had a significant inhibitory effect on Phytophthora capsici， Colletotrichum capsici， Fusarium oxysporum， Sclerotinia scleotiorum， Cytosperma sacculus， Pyricularia oryza， Candida albicans and Staphylococcus aureus. The strain was initially identified by the 16s rDNA sequencing and phylogenetic tree analysis as a strain of Streptomyces carpaticus.

Key words： pepper； soil-borne diseases； endogenous antagonistic actinomycetes； identification of strains； Streptomyces

放線菌是一類具有較大實用價值的微生物，據(jù)報道目前分離到的放線菌不足放線菌總類別的20%[1]。近年來，由于植物內(nèi)生放線菌具有豐富的種屬多樣

性[2-4]、次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因[5]和活性化合物而受到人們的廣泛關(guān)注。課題組于2017年辣椒發(fā)病高峰期在多年連作土傳病害發(fā)生嚴重的辣椒抗病育種試驗田中采集健康的辣椒植株，從其根系分離到了一株內(nèi)生放線菌PES-A23，對其抑菌活性和系統(tǒng)進化地位進行了分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在多年連作土傳病害發(fā)生嚴重的辣椒抗病育種試驗田中采集湖南大面積種植的興蔬215辣椒健康植株為供試材料。

供試病原菌有辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、辣椒炭疽菌Colletotrichum capsici、枯萎病尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum（由湖南省農(nóng)科院蔬菜研究所鄭井元副研究員提供），香梨腐爛病菌Cytosperma sacculus（由塔里木大學(xué)張王斌副教授提供），水稻稻瘟病菌Pyricularia oryza和油菜核盤菌Sclerotinia scleotiorum（湖南省微生物研究院保藏），白色假絲酵母Candida albicans ATCC10231、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC6538、大腸桿菌Escherichia coli ATCC25922（市購）。

供試分離培養(yǎng)基采用高氏1號抑制劑培養(yǎng)基（高氏1號培養(yǎng)基中加入萘啶酮酸、苯菌靈、重鉻酸鉀），常規(guī)放線菌培養(yǎng)采用高氏1號固體培養(yǎng)基，放線菌發(fā)酵采用高氏1號液體培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基pH值均為7.0～7.2。病原細菌、真菌抑菌試驗分別采用LB、PDA 培養(yǎng)基，自然pH值。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生放線菌分離、純化與保藏 按照參考文獻[6]

方法稍作變動。將辣椒側(cè)根剪下，自來水洗凈吹干；超聲清洗1 min；在無菌操作條件下，用乙醇、次氯酸鈉、硫代硫酸鈉依次洗滌，再用無菌水清洗3遍（用最后1次清洗的水涂布平板，28℃培養(yǎng)，檢驗表面消毒效果），置于超凈工作臺中吹干。吹干后剪成小段，放置在分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待長出單菌落，挑取單菌落于高氏1號培養(yǎng)基上劃線分離，得到純培養(yǎng)并做甘油管保藏。

1.2.2 內(nèi)生放線菌抗真菌活性測試 病原真菌的皿內(nèi)拮抗試驗采用對峙培養(yǎng)法[7]，將直徑6 mm新鮮病原真菌菌餅，倒置新PDA板中央，在距離中央3 cm處點接放線菌，培養(yǎng)5～10 d，觀察、測量抑菌圈大小。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物活性測定 內(nèi)生拮抗放線菌在高氏1號培養(yǎng)基中液體發(fā)酵，28℃ 180 r/min培養(yǎng)144～168 h，低溫高速離心，上清經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌；取白色假絲酵母、辣椒青枯病菌、金黃色葡萄球菌菌懸液于固體培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)；取上述病原真菌菌餅倒置在固體培養(yǎng)基平板中央，在距中央3 cm處打孔，加入100 μL內(nèi)生拮抗放線菌發(fā)酵液，分別培養(yǎng)1、3、7 d，觀察抑菌圈并測定大小。

1.2.4 總DNA提取、16S rDNA基因擴增和電泳 無菌條件下將菌體研磨成勻漿狀后，參考UNIQ-10 柱式細菌基因組抽提試劑盒說明書，提取內(nèi)生菌株基因組，采用1%瓊脂糖凝膠電泳測定總DNA濃度。以總DNA 為模板，進行16S rDNA基因擴增。PCR擴增體系：模板DNA 約10 pmol及引物27 F、1492R（10 μmol/L）各1 μL，PCR Mix 25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，

35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物電泳后通過DNA膠回收試劑盒切膠回收，回收的16S rDNA交由湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序。將拼接后的16S rDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行Blast比對，確定PES-A23菌株的分類地位，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 其他活性檢測 參照文獻的方法[8-10]，進行PES-A23菌株解磷、解鉀、固氮、產(chǎn)IAA、鐵載體等活性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離

試驗結(jié)果顯示，經(jīng)過嚴格的消毒措施后，檢驗平板上沒有長出菌落，表明側(cè)根組織表面消毒徹底。分離培養(yǎng)結(jié)束共從側(cè)根中分離到了70株內(nèi)生放線菌，其中一株命名為PES-A23。

2.2 PES-A23菌株形態(tài)特征

PES-A23菌株在高氏1號平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1A所示，生長良好，不產(chǎn)生可溶性色素，可水解淀粉，基絲、氣絲豐富；顯微鏡下氣絲、孢子形態(tài)分別如圖1B、1C所示，氣絲具有高度分枝，孢子橢圓形。

2.3 PES a23菌株抗菌活性

從側(cè)根中分離到的70株內(nèi)生放線菌，經(jīng)過初篩有35株具有抑菌活性。內(nèi)生放線菌PES-A23菌株顯示出較廣的抑菌譜，對辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、枯萎病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、核盤菌（Sclerotinia scleotiorum）、香梨腐爛病菌（Cytosperma sacculus）、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryza均有較強拮抗作用，抑菌圈直徑分別達到16.0、18.1、20.1、14.8、17.4、26.4 mm（圖2-1～6）；培養(yǎng)3～5 d對辣椒白娟菌（Scelerotium rolfsii）也有較好的抑制效果，但隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制圈慢慢消失。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性

從圖2中還可看出，內(nèi)生拮抗放線菌PES-A23的發(fā)酵液對P. capsici、F. oxysporum、C. capsici、S. scleotiorum、C. sacculus、P. oryza、S. aureus和白色假絲酵母C. albicans 8種病原菌都有拮抗作用，抑菌圈直徑分別達到16.4、18.5、20.6、30.0（圖2-7）、30.8（圖2-8）、26.4、18.6（圖2-9）和25.2 mm。這表明PES-A23菌株發(fā)酵產(chǎn)物中含有抑制真菌和細菌的活性成分。

2.5 16S rDNA序列測序、系統(tǒng)發(fā)育分析

PES-A23菌株基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)單一條帶（圖3A）。以 PES-A23菌株基因組DNA為模板，采用通用引物27F和1492R 進行PCR擴增，成功擴增到了1.5 kb 左右的條帶（圖3B），PES-A23菌株的16S rRNA 基因序列長度為

1 378 bp （GenBank 登錄號：MH712039）。Blast比對發(fā)現(xiàn)其序列與鯉鏈霉菌（Streptomyces carpaticus）strain 9-6（登錄號：KJ571065）和strain CTL S12（登錄號：KT818688）的親緣關(guān)系最近，同源性分別達到99.71%、99.56%，初步鑒定為鯉鏈霉菌（Streptomyces carpaticus）（圖4）。

2.6 其他活性檢測結(jié)果

對PES-A23菌株進行溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA等能力的測定，結(jié)果顯示：內(nèi)生拮抗菌PES-

A23能在CAS平板上生長，但不產(chǎn)生橙黃色暈圈，表明它不產(chǎn)鐵載體；在添加色氨酸的高氏1號培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，菌液經(jīng)顏色反應(yīng)測試不變色，陽性反應(yīng)結(jié)果為紅色，表明該菌株不產(chǎn)IAA；在無機磷、有機磷為唯一磷源的培養(yǎng)基上無水解圈，表明其無溶磷能力；在鉀長石和阿須貝無氮培養(yǎng)基上都能很好的生長，說明其可能具有解鉀和固氮活性。

3 結(jié)論與討論

植物與內(nèi)生菌經(jīng)過漫長的進化，彼此之間早已形成和諧的共生關(guān)系。植物供給內(nèi)生菌營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生菌通過不同途徑促進宿主植物生長發(fā)育，增強宿主植物抗脅迫能力[7]。辣椒土傳病害的生防菌和生物防治研究報道較多[11-16]，主要集中在辣椒和其他植物根際土壤內(nèi)生防細菌、鏈霉菌上，對于辣椒內(nèi)生放線菌的分離并不多。從試驗結(jié)果來看，PES-A23菌株具有重要的生防研究價值，為辣椒土傳病害生防菌劑和抗病生防微生物肥料提供了菌種資源，也為辣椒盆栽及田間病害防治奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 楊宇容，徐麗華，李啟任，等. 放線菌分離方法的研究Ⅰ.抑制劑的選擇[J]. 微生物學(xué)通報，1995，（2）：88-91.

[2] 鄭有坤，劉 凱，熊子君，等. 藥用植物內(nèi)生放線菌多樣性及天然活性物質(zhì)研究進展[J].中草藥，2014，（14）：2089-2099.

[3] 楊桂柳，楊立芳，姜明國，等. 北侖河紅樹林內(nèi)生放線菌分離、鑒定及活性研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2015，（7）：894-904.

[4] 張金麗，秦玉麗，熊子君，等. 徐麗華植物內(nèi)生放線菌的選擇性分離[J]. 微生物學(xué)通報，2013，（7）：1305-1313.

[5] 馬 敏. 基于分類系統(tǒng)的紅樹林鏈霉菌次級代謝基因及其產(chǎn)物研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[6] 袁珊珊. 水稻內(nèi)生菌OsiSh-10的分離及其抗稻瘟病與促植物生長的研究[D]. 長沙：湖南大學(xué)，2015.

[7] 廖 敏. 四川阿壩地區(qū)藥用植物內(nèi)生拮抗放線菌的篩選及其防病促生機制研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[8] 康貽軍，胡 健，單 君，等. 兩株解磷真菌的解磷能力及其解磷機理的初步研究[J].微生物學(xué)通報，2006，（5）：22-27.

[9] 張愛民. 解磷解鉀特異菌株CX-7的篩選及其應(yīng)用試驗研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10] 李振東，陳秀蓉，李 鵬，等. 珠芽蓼內(nèi)生菌Z5產(chǎn)IAA和抑菌能力測定及其鑒定[J]. 草業(yè)學(xué)報，2010，（2）：61-68.

[11] 袁樹忠. 辣椒疫霉頡頏菌的篩選鑒定、生防機制及與殺菌劑的協(xié)同作用[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[12] 石晶盈，陳維信，劉愛媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進展[J]. 生態(tài)學(xué)報，2006，26（7）：2395-2401.

[13] 文才藝，吳元華，田秀玲. 植物內(nèi)生菌研究進展及其存在的問題[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：86-91.

[14] 馬 林，韓巨才，劉慧平. 辣椒內(nèi)生放線菌Lj20活性代謝物抑菌作用的研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，（3）：664-668.

[15] 何 紅，蔡學(xué)清，蘭成忠，等. 辣椒內(nèi)生菌BS-2在白菜體內(nèi)的定殖、促生和防炭疽病作用[J]. 植物保護學(xué)報，2004，（4）：347-352.

[16] 黎起秦，盧繼英，林 緯，等. 辣椒內(nèi)生菌拮抗細菌的篩選[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2004，（4）：304-306.

（責(zé)任編輯：成 平）