馬鈴薯卷葉病毒實時熒光定量PCR檢測技術研究

摘 要：研究利用Primer Premier 5.0軟件對 GenBank 數據庫中已登錄的馬鈴薯卷葉病毒全基因組序列進行比對，以管家基因Actin作為內參基因，以馬鈴薯卷葉病毒基因作為目的基因，設計特異性強的引物，采用相對定量法，建立馬鈴薯卷葉病毒的實時熒光定量檢測體系，并利用建立的檢測方法對不同馬鈴薯植株中的馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）進行檢測。結果表明：建立的馬鈴薯卷葉病毒實時熒光定量PCR檢測體系獲得的Real-time PCR 擴增基線平整，指數擴增明顯，斜率大，重復性好，變異系數小；馬鈴薯卷葉病毒cDNA被稀釋104倍后依然能被檢測出來，具有較好的靈敏度；此檢測方法成功檢測出患病植株中含有馬鈴薯卷葉病毒，并對其表達情況進行了相對定量。該方法具有高效、特異性強以及能夠定量檢測等優點，為從分子生物學水平檢測馬鈴薯卷葉病毒提供了一種新手段。

關鍵詞：實時熒光定量PCR；馬鈴薯卷葉病毒；檢測

中圖分類號：Q78； S435.32 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）09-0009-04

Study on Real Time Fluorescence Quantitative PCR Detection Technology of

Potato Leaf Roll Virus

CHEN Zhao-gui，YE Xin-you，XING shu-qi，HOU Hong-yin

（School of Life Sciences， Huizhou University， Huizhou 516007， PRC）

Abstract： Primer Premier 5.0 software was used to align the whole genome sequence of potato leaf roll virus in GenBank database. The housekeeper gene Actin was used as the internal reference gene and the potato leaf roll virus gene was used as the target gene. Designed primers with strong specificity， the real-time fluorescence quantitative detection system of potato leaf roll virus was established， and the PLRV in different potato plants was detected by the established detection method. The results showed that the real-time PCR amplification baseline obtained by the established fluorescence quantitative PCR detection system for potato leaf roll virus was flat， the exponential amplification was obvious， the slope was large， the repeatability was good， and the coefficient of variation was small. Potato leaf roll virus cDNA can be detected after being diluted for 104 times and has good sensitivity. Potato leaf roll virus was successfully detected in diseased plants by this method， and its expression was quantified. This method has the advantages of high efficiency， strong specificity and quantitative detection， and provides a new method for the detection of potato leaf roll virus from the molecular biological level.

Key words： real time fluorescence quantitative PCR； potato leaf roll virus （PLRV）； detection

馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）是馬鈴薯卷葉病毒屬的一員，嚴重危害馬鈴薯生產，被歸類為黃化病毒組（Luteovirus）。PLRV病毒粒體呈球狀，等軸對稱，直徑24 nm，是一種正鏈RNA病毒，無3′端polyA，5′端嚴格保守的序列長5～20 bp[1]。該病毒可通過種薯傳播，也可在田間以持久方式由蚜蟲進行傳播，但不能通過機械傳播。寄主植物的維管束是病毒主要的分布部位[2]。該病毒在寄主體內含量較低，難以大量提純，致使其分子水平的研究進展不大[3]。鑒定PLRV傳統的方法有目測法、生物學實驗法（也稱為“指示植物法”）和電鏡技術法等。隨后出現了酶聯免疫檢測法和核酸分子檢測技術[4-6]。與實時熒光定量PCR技術相比，其他方法都存在一些不足之處，如耗時較長、檢測材料消耗量大、靈敏度低以及不能夠對病毒進行定量檢測等[7]。實時熒光定量PCR技術特異性強、靈敏度高，不僅可以實現樣本的實時快速檢測，而且能夠對樣本進行定量分析[8-9]。

研究擬建立一種實時熒光定量PCR方法，用于惠州地區冬種馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）的特異性定量檢測。這對惠州馬鈴薯卷葉病毒的防控以及馬鈴薯產質量的提升等有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在廣東省惠東縣鐵涌鎮九華馬鈴薯基地進行，觀察馬鈴薯帶毒植株的癥狀，并根據癥狀初步鑒定馬鈴薯樣本是否感染PLRV。采集樣本并編號，于-80℃下保存待測。

RNAiso Plus試劑盒、1st Strand cDNA Synthesis Kit

試劑盒（PrimeScript ?）和Premix Ex Taq ?II（TB Green?）均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯總RNA的提取 參照RNAiso Plus試劑盒方法進行總RNA的提取。使用超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，以檢驗所提RNA質量是否合格。用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，通過凝膠成像分析系統觀察并成像。

1.2.2 cDNA 合成體系及條件 使用質量合格的總RNA進行反轉錄合成cDNA，合成體系及條件按照1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行。

1.2.3 引物設計 依據GenBank數據庫中己經公布的PLRV基因組序列與馬鈴薯全基因序列，以Actin基因為內參基因，遵循熒光定量PCR引物設計原則，采用Primer Premier 5軟件程序分別設計出1對內參基因序列和1對目的基因引物序列。引物序列如表1所示，由寶生物工程（大連）有限公司制作合成。

1.2.4 Real-time PCR反應體系及條件 依據Premix Ex Taq ?II說明書推薦的20 μL反應體系進行實時熒光定量PCR反應。各成分用量如下：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，DNA 模板2 μL，滅菌水6 μL。實時熒光定量PCR在QuantStudio? 7 Flex Real-Time PCR System上運行，PCR 擴增標準程序設置成3個階段：第一階段，預熱保溫50.0℃ 2 min，預變性95.0℃ 10 min；第二階段，變性95.0℃ 15 s，退火延伸60.0℃ 1 min；第三階段，95.0℃ 15 min，60.0℃ 1 min，隨后以0.05℃/s的變溫速度升溫到95.0℃；期間儀器自動收集熒光信號，得到擴增曲線、溶解曲線。

1.2.5 PLRV cDNA的靈敏度檢測 將合成的PLRV基因和內參Actin基因的cDNA，按10倍稀釋法將cDNA初始模板稀釋成5個濃度梯度，稀釋倍數分別為101、102、103、104、105，每個稀釋梯度重復3次，采用20 μL體系進行實時熒光PCR，以確定馬鈴薯PLRV cDNA的靈敏度。

1.2.6 方法的重現性檢驗 采用5倍稀釋法將合成的PLRV基因cDNA稀釋成6個梯度，稀釋倍數分別為50、51、52、53、54、55，每個梯度設置3次重復，作為模板進行實時熒光定量PCR擴增，考察每個稀釋倍數重復間Ct值的誤差及變異系數，以檢驗該方法的重現性。

1.2.7 馬鈴薯卷葉病毒Real-time PCR技術的應用效果分析 選取馬鈴薯脫毒植株2株和感染PLRV發病癥狀明顯的植株4株，共計6株植株，按照1.2.1方法進行總RNA提取；將質量合格的RNA按照1.2.2方法合成cDNA第一鏈；以cDNA為模板按照1.2.4方法進行Real-time PCR擴增。以常規RT-PCR檢測方法[10]作對照。

1.2.8 Real-time PCR結果數據處理 采用熒光定量PCR的相對定量法進行相對定量，所得數據利用QuantStudio? 7 Flex Real-Time PCR System自帶的程序及 Microsoft Office Excel 2016軟件進行分析整理。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果

從RNA的純度（OD260/OD280）來看，試劑盒提取的RNA OD260值為4.343，OD280值為2.134；OD260/OD280的比值為2.04，在2.0左右，表明RNA中沒有混入DNA、多糖和蛋白質等雜質，純度較好。由圖1可知，試劑盒提取的RNA中28 s和18 s這兩條亮帶最亮，5 s亮帶較淡，幾乎沒有明顯拖帶現象，說明所提取的RNA幾乎沒有明顯的降解，完整性較好。綜合純度檢測結果和完整性檢測結果，試劑盒提取的RNA質量符合后續反轉錄反應對模板質量的要求。

2.2 cDNA的靈敏度

如圖2、3所示，PLRV基因和內參Actin基因在初始模板濃度很低的情況下，仍有較好的擴增效率，靈敏度好。從擴增曲線可以看出，二者擴增過程中指數擴增明顯，沒有出現異常擴增的現象。

2.3 擴增產物序列測定

以引物PLRV2-F和 PLRV2-R擴增出的目的產物交由廣州華大基因科技股份有限公司進行純化及測序，結果表明擴增片段長度為143 bp，測序結果如下：5'-TAGTCGCTAGAGACTGGAGTTCCCCGAGGACGAGGCTCAAGCGAGACATTCGTGTTTACAAAGGACAACCTCATGGGCAACTCCCAAGGAAGTTTCACCTTCGGGCCGAGTCTGA-3'。

在http： //www.ncbi.nlm.nih.gov 網站對所測序列進行BLAST比對分析，結果顯示，該PCR擴增序列與國內外已報道的多個PLRV分離物（編號為MF

062487.1、MF276879.1等）核苷酸序列同源性達99%。這說明引物PLRV2-F和 PLRV2-R擴增出來的基因片段是PLRV基因片段。

2.4 重現性分析

從表2中可以看出，每個稀釋倍數重復間Ct值的誤差和變異系數都很小，說明該研究所構建的馬鈴薯卷葉病毒基因檢測方法重現性較好，試驗結果穩定可靠。

2.5 馬鈴薯卷葉病毒實時熒光定量PCR技術的應用效果

2.5.1 常規RT-PCR檢測結果 如圖4所示，2株脫毒植株未擴增出PLRV基因片段，其余4株均擴增出長度為143 bp的PLRV基因片段，說明這4株植株均檢測出PLRV。

2.5.2 實時熒光定量PCR檢測結果 由圖5可知，樣品的擴增曲線沒有出現異常擴增情況，說明檢測結果正常可靠。其中的直線B是2個脫毒植株樣品PLRV的擴增曲線，擴增曲線在ΔRn=0.000處，循環數從0開始到40結束都是一條直線，沒有出現指數增長，說明未感染PLRV，因此不會擴增出PLRV；其余4個樣品的內參基因和PLRV的擴增曲線，呈現指數增長，沒有出現異常擴增現象，且指數增長明顯，曲線平滑且，說明植株感染了PLRV。

因管家基因Actin在各組織中的表達恒定，因此以它作為內參，比較不同患病樣品中PLRV基因表達量的差異，以其中感染PLRV的患病植株1為參照，結果如圖6所示，患病植株2、3、4中PLRV的相對表達量分別為3 655.653、0.992、551.054。這說明以患病植株1為參照時，4株感病植株馬鈴薯卷葉病的染病程度依次為植株2>植株4>植株1>植株3。

3 結論與討論

3.1 馬鈴薯卷葉病毒的初步鑒定

首先采取目測法對收集的馬鈴薯植株進行初步觀察，鑒定其是否染病，然后根據馬鈴薯植株感染病毒后呈現出來的癥狀來判斷感染的病毒是否為PLRV。但是目測法結果帶有較大不確定性，需要對馬鈴薯樣本進行分子鑒定才能確定是否感染PLRV。因此，釆用靈敏度較高的常規RT-PCR技術進行定性鑒定，以確定有染病癥狀的馬鈴薯植株感染了哪種病毒。從常規RT-PCR鑒定結果來看，植株確定為PLRV感染。

3.2 RNAsio Plus 試劑盒方法提取RNA的可靠性

相關參考文獻已報道，試劑盒和異硫氰酸胍這2種方法提取出的總RNA質量較好[11]。研究采用RNAsio Plus試劑盒的方法提取植株總RNA，從電泳結果與純度檢測結果來看，該方法提取出來的RNA質量較好，可用于實時熒光定量RT-PCR檢測。

3.3 實時熒光定量PCR檢測PLRV技術的可靠性

研究以Actin基因為內參基因，以PLRV基因作為目的基因，采用相對定量方法，建立了實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并且在準確性、靈敏度和重復性等方面對建立的檢測方法體系進行了驗證。結果表明，研究建立的馬鈴薯卷葉病毒熒光定量PCR檢測體系獲得的Real-time PCR 擴增基線平整，指數擴增明顯、斜率大、重復性好、變異系數小；馬鈴薯卷葉病毒cDNA被稀釋104倍后依然能被檢測出來，具有較好的靈敏度；此檢測方法的結果與常規RT-PCR結果一致，能在分子水平上檢測出馬鈴薯植株中存在的馬鈴薯卷葉病毒，并能對病毒基因的表達情況進行定量分析。同時，該方法具有高效、特異性強以及能夠定量檢測等優點，為從分子生物學水平檢測馬鈴薯卷葉病毒提供了一種新手段。

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（責任編輯：成 平）