魚類水霉病植物源性殺菌劑的篩選

摘 要：為探究魚類水霉病植物源性殺菌劑的抑菌效果，以水霉病菌為供試病菌，選取了多種具有消炎、殺菌功效的藥用植物進行抑菌活性篩選，以抑菌圈直徑大小為指標，確定植物提取物對水霉菌的抑菌效果；篩選抑菌效果較強的植物提取物，測定其對水霉菌的最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC），以及其對水霉菌生長抑制率、菌絲生長量的影響。結果表明：黃連、油茶餅、大黃等植物提取液對水霉菌的生長具有較強抑制效果；三者對水霉菌的MIC值均較低，分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對水霉菌的MBC值相差不大，均在為50 mg/mL左右。總體上，黃連表現出了相對最優的抑菌效果，當黃連提取液處理濃度達到500 mg/L時，抑菌率達到97%以上，菌絲鮮重低于0.02 g，抑菌效果最佳。

關鍵詞：水霉病；魚類；植物源性提取物；抑菌

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）09-0084-05

Screening of Botanical Fungicides for Fish Water Mildew

QI Jian-bo1，HE Xiao-e2，HU Qian2，GUO Yang1，SHI Hao1，2

（1. College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC； 2. College of Agriculture

and Forestry， Hunan Applied Technology University， Changde 415000， PRC）

Abstract： To explore t the antibacterial effect of plant extracts against Botryosphaeria dothidea， and to provide direction for the development and use of safe and effective drugs for the treatment. In this paper， Botryosphaeria dothidea was used as test pathogens. A variety of plants with anti-inflammatory and bactericidal were selected for antibacterial activity screening. The growth rate and growth of mycelia were used as indicators to determine the antibacterial effect of plant extracts on Botryosphaeria dothidea. Then， the plant extracts with effective antibacterial effect were selected to determine the minimum inhibitory concentration （MIC）， the minimum bactericidal concentration （MBC）， and the growth inhibition rate and mycelial growth of Botryosphaeria dothidea. The experimental results showed that the extracts of Coptis chinensis， Camellia and Rheum palmatum have effective inhibitory effects on the growth of Botryosphaeria dothidea. The MIC values of the three extracts were 3.125 mg/mL， 6.25 mg/mL and 12.5 mg/mL， there was no significant difference in the MBC values， and they were all around 50 mg/mL. In general， Coptis chinensis showed the best antibacterial effect， when the concentration of Coptis chinensis extract reached 500 mg/L， the antibacterial rate reached more than 97%， and the fresh weight of hyphae was less than 0.02 g.

Key words： saprolegniasis； fish； plant extract； antibacterial

水霉病（Saprolegniasis），又叫膚霉病（Derma-tomyeosis）或白毛病，是淡水水生動物較常見的疾病之一，該病是由于水霉菌寄生在魚體表面引起的一種高致病性真菌性疾病[1]。如果菌絲附著在魚鱗上，經常導致鱗片脫落[2]。當受傷較深時，水霉菌可向內深入肌肉，蔓延到組織細胞間隙，向外長成的菌絲，呈灰白色的棉毛狀，故稱“白毛病”，在高密度的成魚飼養過程中常發生此病[3]。過去使用安全性較低的孔雀石綠作為該疾病的首選藥物，但孔雀石綠具有高毒性、致癌、致畸和致突變的副作用，我國于2000年將其列為禁用藥物[4]。因此，迫切需要尋找一種更加安全有效的藥物來控制該疾病。

相比較于化學合成藥物，中草藥是一種理想的天然綠色藥物，具有來源廣、成本低、藥效長、使用方法簡單等優點[5]。其機理是阻斷或破壞真菌結構及大分子的生物合成、干擾真菌的能量代謝、通過改善和提高生物體免疫功能和對其他抗真菌藥物的增效作用來殺滅或抑制真菌[6]。此外，還具有副作用少、毒性低、不易產生抗藥性等特點[7]，加之其本身含有一定營養物質，如粗蛋白、粗脂肪、維生素等，可以提高飼料轉化率，近年來被廣泛用于防治各類水生經濟動物病害[8]。研究表明，五倍子或菖蒲能有效地防治魚類水霉病的發生[9]。李川等[10]用中草藥對患水霉病大鯢（Andrias davidianus）進行治療，結果顯示大黃和五倍子2種藥液均對水霉菌有較好的抑制作用。筆者通過選擇多種植物源性殺菌劑，以水霉病菌為供試病菌，采用牛津杯法對植物提取物的抑菌效果進行了研究，以期為魚類水霉病的綠色防治探索出新途徑，為解決魚類水霉病無公害藥物的研制與開發提供方向，達到提高水產養殖行業的經濟效益、減少養殖戶經濟損失的目的，同時提高水產品的食品安全，提升人民健康水平。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料與試劑 供試植物共有64種，購于湖南九芝堂醫藥有限公司和湖南養天和大藥房，部分常見植物自行采摘。藥材經湖南農業大學藥用植物資源工程專業肖深根教授鑒定。藥材名稱及藥用部位列于表1。供試菌種為水霉菌（Botryosphaeria dothidea），由湖南文理學院生命科學院羅玉雙教授提供。葡萄糖、瓊脂粉、丙酮（中國醫藥集團上海化學試劑公司）試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設備 HVA-85全自動高壓蒸汽滅菌鍋（上海天呈醫流科技股份有限公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱（無錫建儀實驗器材有限公司）；DH5000B電熱恒溫培養箱（西安禾普生物科技有限公司）；FA2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；pH計（METTLER TOLEDO公司）；TGCXZ-5B超聲循環提取機（北京弘祥隆公司）；FW100萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；Buchi R3旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；LX-600P冷卻水循環機（北京長流科學儀器公司）；DSZ2000X倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司）；SR-A10N-50冷凍干燥機（上海舍巖儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物源性提取液的制備 （1）植物藥材打粉處理。采摘原植物經自然風干后放入50℃烘箱，烘干至恒重，用粉碎機粉后碎過100目篩。（2）提取液制備。分別稱取各植物樣品粉末10 g于100 mL三角瓶中，加丙酮50 mL用保鮮膜封口，18℃ 150 r/min恒溫振蕩提取12 h后，將三角瓶放入超聲儀中，再經超聲波提取30 min，然后將提取液抽濾，濾液濃縮至10 mL以內，倒入10 mL容量瓶中定容。配成活性物質提取物，質量濃度1.0 g/mL，對提取物母液進行編號，置于4℃冰箱中，保存備用。另將黃連、油茶、大黃提取物減壓濃縮后冷凍干燥。

1.2.2 菌液的制備 菌種活化后接種于PDA培養基，18℃培養72 h，取直徑約為4 cm的菌落于5 mL離心管中，用加2%吐溫80的無菌0.9%生理鹽水沖洗，再用玻璃珠打散，震蕩、離心、過濾菌絲。采用血球板計數法確定菌懸液濃度[11]，濃度控制在105～106 CFU/mL之間，備用。

1.2.3 PDA培養基的配制 將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，切成2 cm大小于1 L的燒杯中，加入蒸餾水300 mL左右，在電爐上煮沸30 min。抽濾得濾液，濾液到入燒杯中，相繼添加瓊脂15 g、葡萄糖16 g，加蒸餾水補至1 L，攪拌，放入微波爐中待其充分融化，自然pH值，分裝于250 mL錐形瓶中，加膜、包扎，121℃滅菌20 min，取出冷卻至40℃左右，鋪板或4℃冰箱保存。

1.2.4 提取液抑菌活性的測定 （1）抑制效果的測定。采用牛津杯法測定提取液對水霉菌的抑制率[12]。將PDA培養基倒入10 mL培養皿中至0.5 cm深度，凝固后，加入濃度為105～106個孢子/mL的菌懸液0.5 mL，用滅菌的小毛刷充分涂勻。取滅菌的牛津杯插入培養基中0.2 cm深度，每個培養皿等距離放置4個，再往各牛津杯中加入200 μL各植物提取液（采用0.22 μm的有機膜濾掉雜菌），用封口膜封口，置于18℃培養箱中培養，每個植物樣本做4個重復，以丙酮試劑為陰性對照，以80 μg/mL納他霉素為陽性對照。培養72 h后用游標卡尺、十字交叉法測定抑菌圈直

徑[13]。其中：菌落凈生長距離（cm）=菌落生長距離-菌餅直徑。（2）最低抑菌濃度（MIC）值的測定。取12孔板編號倒入底層培養基待凝固后，將植物提取液混入40℃培養基中，最終濃度為1、10、20、30、50、100、200、300、400、500、700、1 000 mg/mL，倒入培養基上，待凝固后鋪上濃度為105～106個孢子/mL的菌懸液0.3 mL，用滅菌的小毛刷充分涂勻。置于18℃的培養箱中培養，觀察菌體生長情況，記錄數據。（3）最低殺菌濃度（MBC）值的測定。將大于最低抑菌濃度的各提取液對倍提高濃度，混入40℃培養基中，并分別倒在底層培養基上，待凝固后鋪上菌懸液，用滅菌的小毛刷充分涂勻。置于18℃的培養箱中培養，觀察菌體生長情況，記錄數據。確定無菌生長的最底提取液濃度。

1.2.5 提取物對菌生長抑制率的測定 提取物分別按質量濃度0（CK）、10、50、100、300、500 mg/L制成PDA平板，在超凈工作臺上，將直徑0.9 cm的供試病菌菌餅塊置于含藥劑的培養基平板中央，每皿1塊，每處理3次重復，置于18℃培養箱中培養4 d。按公式（1）計算菌絲生長抑制率[14]。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離）/對照菌落凈生長距離×100 （1）

1.2.6 菌絲生長量的測定 對水霉菌絲生長量抑制作用的測定在液體培養基中進行。于三角瓶中加入培養基后高壓滅菌；將活化好的水霉菌用無菌生理鹽水清洗，過濾掉菌絲，制得孢子懸浮液（106 CFU）。培養基冷卻后在無菌條件下用移液槍加入孢子懸浮液1 mL，18℃振蕩培養，待菌絲球生長良好時加入提取物，對照不加。繼續培養2～3 d，待菌絲球長到直徑為0.5～1.0 cm。過濾得菌絲體，用蒸餾水反復沖洗菌絲，將培養基去除干凈，精確稱取菌絲體的鮮量。每個處理重復5次，試驗重復2次。

2 結果與分析

2.1 不同植物提取液的抑菌活性

2.1.1 各植物提取液對菌體的抑制效果 由表2可知，24種植物提取液對水霉菌顯示出不同程度的抑菌效果，其中以黃連、油茶餅、大黃、苦參、五倍子、丁香、鳳尾蕨等的提取液抑制作用較為明顯，抑菌圈直徑均在20 mm以上。黃連提取物的抑菌效果最明顯，抑制直徑達36.1 mm，其原植物體內可能有某種生物堿對水霉菌抑制效果較好[15]。同理推測大黃中可能含有某種蒽醌[16]、油茶中含某種皂甙對水霉菌也有較好的抑制效果[17]，今后可提取分離各組分作進一步分析。還有可能是丙酮的極性與這3種藥材的有效成分極性相似，更易溶，故提取效果更好一些[18]。

2.1.2 各植物提取液對菌體的MIC和MBC 由表3可知，黃連、油茶餅、大黃對水霉菌的MIC值較低，分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對水霉菌的MBC值均為50 mg/mL。可見，黃連、油茶餅和大黃的對水霉菌抑制效果突出。其中，黃連的MIC最低，說明其對水霉菌抑制效果最好，與十字交叉法測定抑菌圈直徑試驗結果相同。且該試驗抑菌效果和十字法測定的抑菌圈直徑結果基本一致，2個試驗互相印證了幾種植物提取液對水霉菌的抑制作用。

2.2 不同濃度植物提取物對水霉菌生長的抑制率

2.2.1 油茶餅提取物 由圖1可知，油茶餅提取物對水霉菌菌絲生長具有抑制作用。隨著提取物濃度增強，對水霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增強，但是有其一定的范圍；當油茶餅提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時，抑制率由95%增至97%，增長效果不明顯。因此，油茶餅提取物濃度在300～500 mg/L時抑菌效果最佳。

2.2.2 黃連提取物 由圖2可知，黃連提取物對水霉菌菌絲生長具有抑制作用。隨著提取物濃度增強，對水霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增強，但是有其一定的范圍；當提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時，抑菌率由97%增至99%，增長效果不明顯。因此，考慮到應用成本，黃連提取物濃度在300～500 mg/L時抑菌效果最佳。

2.2.3 大黃提取物 由圖3可知，大黃提取物對水霉菌菌絲生長具有抑制作用。隨著提取物濃度增強，對水霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增強，但是有其一定的范圍；當大黃提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時，抑菌率由87%增至90%，增長效果不明顯。因此，大黃提取物濃度在300～500 mg/L時抑菌效果最佳。但與油茶餅和黃連相比，對水霉菌的抑制效果稍弱。

2.3 不同濃度植物提取物對水霉菌生長量的影響

2.3.1 油茶餅提取物 由圖4可知，當油茶餅提取物濃度為0、100、500、1 000 mg/L時，菌絲鮮重分別為0.121、0.063、0.008、0.005 g，再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強不明顯。這說明當油茶餅提取物濃度在0～500 mg/L時，對水霉菌菌絲生長量減少作用變化最明顯。

2.3.2 黃連提取物 由圖5可知，當黃連提取物濃度為0、100、500、1 000 mg/L時，菌絲鮮重分別為0.121、0.072、0.014、0.006 g，再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強不明顯。這說明當黃連提取物濃度在0～500 mg/L時，對水霉菌菌絲生長量減少作用變化最明顯。當油茶餅和黃連提取物濃度處于同一水平時（1 000 mg/L），油茶餅提取物的抑制效果略強于黃連，與上述試驗結果稍有差異，推測可能是達到了一定極限范圍時，油茶餅提取物的抑菌效果與黃連提取物抑菌效果相差不大。

2.3.3 大黃提取物 由圖6可知，當大黃提取物濃度是0、100、500、1 000 mg/L時菌絲鮮重為0.121、0.092、0.042、0.032 g，說明當大黃提取物濃度在100～500 mg/L時，對水霉菌菌絲生長量減少作用變化最明顯。在提取物濃度為500和1 000 mg/L時，大黃提取物抑菌效果相差不大，且弱于黃連和油茶餅的抑菌效果。

3 結論與討論

在廣泛查閱文獻的基礎上，選取了64種具有抑菌活性的中草藥植物，測定其對水霉菌的離體抑制效果。結果表明，有23種植物提取液對水霉菌表現出不同程度的抑制效果，其中以黃連、油茶餅、大黃、苦參、五倍子、丁香、鳳尾蕨等植物的提取液對水霉菌效果較好，抑菌圈直徑均達20 mm以上。尤其是黃連、油茶餅和大黃的抑菌效果突出，其提取物的MIC分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對水霉菌的MBC均為50 mg/mL。同時發現隨著植物源提取物濃度增強，對水霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增強，但是當抑制范圍達到一定程度時，即使再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強不明顯，油茶餅、黃連、大黃提取物濃度都在300～500 mg/L時抑菌率增效不明顯；即提取物濃度在0～500 mg/L時，對水霉菌菌絲生長的抑制作用最強。黃連提取液濃度達到500 mg/L時，抑菌效果最佳，幾乎可對水霉菌進行完全抑制，在未來魚類養殖生產中應用于魚類水霉菌的綠色防控。

目前對植物源提取物的抑菌試驗還處在室內細菌培養階段，后期可研發魚類水霉病植物源性殺菌劑進行室外防治研究，并且分析其具體成分和作用機理，為今后相關安全有效藥物的開發與使用提供一定理論依據。

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（責任編輯：夏亞男）