?野桑蠶br-c基因的克隆與序列分析

摘 要：昆蟲BR-C（Broad complax）蛋白是一個(gè)含BTB結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)蛻皮激素20E和保幼激素JH的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是昆蟲變態(tài)發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因之一。研究克隆了野桑蠶br-c基因開放閱讀框及其上下游的部分非翻譯區(qū)序列，并對(duì)該基因編碼序列進(jìn)行了特征分析。結(jié)果表明：野桑蠶BR-C蛋白具有保守的BTB和ZnF-C2H2結(jié)構(gòu)域，N端含有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)等結(jié)構(gòu)。聚類分析表明：家蠶與野桑蠶在親緣關(guān)系上最為接近，其BR-C蛋白序列基本一致。

關(guān)鍵詞：野桑蠶;家蠶;br-c基因;BTB結(jié)構(gòu)域;變態(tài)發(fā)育

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）10-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of BR-C Gene from Bombyx mandarina

LING Jun，CHU Qu，PENG Yun-wu

（Shanxi Key Laboratory of Sericulture， Ankang University， Ankang 725000， PRC）

Abstract： Insect BR-C （Broad complax） protein is a transcription factor containing BTB domain and zinc finger domain. It mediates the signal transduction of ecdysone 20E and juvenile hormone JH， and is one of the key genes in the regulation of insect metamorphosis. The open reading frame （ORF） of the BR-C gene of Bombyx mandarina and the sequence of its upstream and downstream untranslated regions were cloned and analyzed. The results showed that the BR-C protein of Bombyx mandarina had conserved BTB and ZnF-C2H2 domains， and N-terminal contained extracellular， transmembrane and intracellular domains. Cluster analysis showed that the BR-C protein of Bombyx mori and Bombyx mandarina was the closest in genetic relationship， and the two protein sequences were consistent.

Key words： Bombyx mandarina; Bombyx mori; BR-C gene; BTB domain; metamorphosis development

昆蟲的生長(zhǎng)和發(fā)育主要受保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）的系統(tǒng)調(diào)控，因此探究這2種激素的代謝調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)途徑是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子BR-C（Broad complex）是20E的初級(jí)應(yīng)答基因之一，最早是在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中被發(fā)現(xiàn)的[3]。br-c基因在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其突變會(huì)影響其他20E初級(jí)應(yīng)答基因及蛻皮相關(guān)的20E次級(jí)應(yīng)答基因的表達(dá)[4]。在果蠅中，br-c突變使其不能完成幼蟲至蛹的轉(zhuǎn)化，而幼蟲期br-c基因表達(dá)上調(diào)可抑制幼蟲表皮基因的表達(dá)，而激活蛹表皮基因的表達(dá)[5]。黑腹果蠅、煙草天蛾（Manduca sexta）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）和家蠶（Bombyx mori）中的研究表明，BR-C的生物學(xué)功能是十分保守的，參與調(diào)控了胚胎發(fā)生、翅分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、表皮蛋白合成、卵巢干細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等多個(gè)發(fā)育事件[6-10]。研究還發(fā)現(xiàn)，br-c基因存在多種剪接形式。在黑腹果蠅中，br-c存在z1、z2、z3和z4等4種不同剪接體，家蠶中則僅鑒定出z1、z2和z4這3種異構(gòu)體形式[11]，赤擬谷盜中則多達(dá)5種[12]。不同br-c剪接體編碼蛋白的C端都含有一個(gè)保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（C2H2-ZF），N端則含有一個(gè)保守的BTB結(jié)構(gòu)域，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因而屬于BTB-ZF類轉(zhuǎn)錄因子家族[13]。BTB/ZF蛋白在不同昆蟲結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性，它們?cè)诩せ罨蛘咭种瓢袠?biāo)基因的表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用，其中BTB結(jié)構(gòu)域是決定該蛋白與其他蛋白相互作用的最主要功能域[14]。果蠅BR-C與家蠶相應(yīng)序列一致性達(dá)90.3%，與其他昆蟲也有相對(duì)較高的一致性，暗示著BR-C在不同物種中發(fā)揮著類似的功能。

野桑蠶是寡食性昆蟲，主要以桑葉為食，是桑園的主要害蟲。野桑蠶與家蠶具有共同的祖先，但經(jīng)過物種進(jìn)化和長(zhǎng)期人工選擇，二者在許多發(fā)育性狀方面表現(xiàn)出顯著差異，因此野桑蠶是研究家蠶馴化機(jī)制及培育家蠶種質(zhì)改良的重要生物學(xué)材料[15-16]。由于材料不便于獲取以及難于室內(nèi)飼養(yǎng)等原因，野桑蠶變態(tài)發(fā)育相關(guān)的研究報(bào)道較少。筆者克隆了野桑蠶br-c同源基因序列，分析其序列特征，比較了野桑蠶與家蠶br-c序列的差異，為深入開展br-c基因在桑蠶發(fā)育調(diào)控中的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

研究所使用的昆蟲為野桑蠶，由陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 野桑蠶總RNA的抽提和cDNA第一鏈的合成

利用Trizol試劑（Invitrogen，USA）抽提5齡第3天的野桑蠶全蠶總RNA，采用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo）檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invertrogen， Carlsbad，CA）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 野桑蠶br-c基因的克隆和測(cè)序

采用Oligo6.0軟件，根據(jù)已報(bào)道的家蠶br-c基因（NCBI ref. ID： NM_001173377.1）設(shè)計(jì)引物。引物p1：

5'-ATTTTTGTGCATTTTCTA3'，5'-AATAGCAGCAT-3';p2：5'- AAGTGAAAGGACTTACTGGA-3'，5'-TTGAC

ACAAATTGACAACAATC-3'，預(yù)測(cè)擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為1 335 bp和1 224 bp。

以野桑蠶cDNA為模板，克隆br-c基因同源序列。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min;94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 100 s，26次循環(huán);72℃ 10 min，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物采用1.20%（w/v）的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的片段，利用T克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑選陽性克隆斑點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，送交測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果使用Lasergene軟件包下的SeqMan子程序去除接頭污染，之后進(jìn)行序列拼接，組裝成單一序列。

1.4 信息學(xué)分析

從CNBI數(shù)據(jù)庫獲取家蠶和其他物種的br-c核酸及蛋白序列;利用Clustalx軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)和相似性分析;通過MEGA6.0軟件以鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1 000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion）;利用ExPASY（http：//wed.expasy.org/compute_pi）、SMART（http：//small.embl-heidelberg.de/）、PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/）等在線工具分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守基序及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 野桑蠶br-c基因的克隆

利用管家基因actin3檢測(cè)cDNA模板質(zhì)量，結(jié)果如圖1a所示，擴(kuò)增條帶單一、清晰，表明cDNA模板質(zhì)量較好。針對(duì)桑蠶br-c基因設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物（p1、p2），以反轉(zhuǎn)錄合成的野桑蠶cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1b所示，所設(shè)計(jì)的引物均正常擴(kuò)增出條帶，表明引物可用。

將所測(cè)序列去除載體等無關(guān)序列之后，拼接成單一的克隆片段，獲得一段長(zhǎng)度為1 669 bp的核酸序列，經(jīng)序列比對(duì)和開放閱讀框（ORF）分析，結(jié)果顯示所得序列與家蠶br-c基因相似度最高，表明擴(kuò)增得到的即為野桑蠶br-c基因，所獲序列中包含br-c基因ORF框，位于克隆序列的121至1 515區(qū)域內(nèi)，ORF長(zhǎng)度為1 395 bp，編碼464個(gè)氨基酸殘基（圖2）。對(duì)野桑蠶和家蠶br-c同源序列進(jìn)行聯(lián)配分析，結(jié)果表明在核酸序列上，二者在459和1 441這2個(gè)位點(diǎn)上堿基存在差異，均位于ORF框內(nèi)（圖2）。

2.2 野桑蠶BR-C蛋白序列分析

在克隆得到野桑蠶br-c開放閱讀框基礎(chǔ)上，對(duì)編碼蛋白的序列特征進(jìn)行了分析。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，野桑蠶BR-C蛋白N端含有一個(gè)保守的BTB結(jié)構(gòu)域，C端含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（圖3）。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白從N端起始，依次有40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的胞外結(jié)構(gòu)（Extracellular Region），16個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（Transmembrane Helix）和63個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（Cytoplasmic Region），表明該蛋白可能位于脂膜上，通過兩側(cè)的結(jié)構(gòu)域傳遞細(xì)胞信號(hào)（圖4）。

蛋白序列聯(lián)配分析表明，野桑蠶與家蠶BR-C蛋白序列完全一致，表明二者具有高度的保守性，暗示著二者可能有著相似的生物學(xué)功能和調(diào)控途徑。不同昆蟲的BR-C蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明，編碼蛋白在N端胞外結(jié)構(gòu)區(qū)域和BTB結(jié)構(gòu)域序列的一致性較高，其次為C端的鋅指結(jié)構(gòu)域，而BTB和ZnF結(jié)構(gòu)之間的鉸鏈區(qū)則相似性最低（圖5）。

2.3 BR-C遺傳進(jìn)化分析

利用BR-C蛋白序列分析了其在昆蟲之間的聚類關(guān)系，結(jié)果如圖6所示。在總體上，昆蟲中BR-C蛋白聚為2個(gè)大類，其中鱗翅目、膜翅目及雙翅目聚為一類，鞘翅目、直翅目、半翅目等聚為另一類。野桑蠶（Bombyx mandarina）與家蠶（Bombyx mori）同為一枝，表明其親緣關(guān)系最為接近，二者與小菜夜蛾（Plutella xylostella）、帝王蝶（Danaus plexippus）等共同聚為昆蟲中的鱗翅目亞群，暗示著野桑蠶的BR-C蛋白具有和家蠶相似的生物學(xué)特征。

3 討 論

通過長(zhǎng)期人工選擇和馴化，家蠶與其馴化祖先野桑蠶在許多發(fā)育性狀方面表現(xiàn)出明顯差異，而探索這些差異的分子機(jī)制為昆蟲變態(tài)發(fā)育研究、家蠶遺傳改良等提供了理論基礎(chǔ)和分子靶標(biāo)[17]。昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要受蛻皮激素和保幼激素的協(xié)同調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Broad Complex（BR-C）是昆蟲20E和JH信號(hào)通路的關(guān)鍵作用因子之一。因此，BR-C在變態(tài)發(fā)育過程中的作用機(jī)制受到廣泛研究和高度關(guān)注[18-19]。該研究克隆了野桑蠶br-c基因開放閱讀框及其上下游的部分非翻譯區(qū)，并對(duì)該基因序列特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明野桑蠶br-c基因與家蠶僅在ORF框內(nèi)存在2個(gè)位點(diǎn)上的堿基差異，編碼的蛋白質(zhì)在序列上與家蠶高度一致，具有保守的BTB和ZnF-C2H2結(jié)構(gòu)域;二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白自N端起始依次含有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。聚類分析表明，家蠶與野桑蠶親緣關(guān)系最為接近。這些結(jié)果表明，野桑蠶BR-C蛋白在生物學(xué)功能及調(diào)控途徑等方面與家蠶可能具有較高相似性。鑒于家蠶與野桑蠶發(fā)育性狀的差異，而br-c基因又被認(rèn)為是昆蟲變態(tài)發(fā)育，尤其是蛹發(fā)育的重要調(diào)控因子，因此深入鑒定br-c基因的調(diào)控模式，探索其在野桑蠶變態(tài)發(fā)育中的作用，比較家蠶、野桑蠶二者之間的功能和調(diào)控異同，可以為昆蟲變態(tài)發(fā)育機(jī)制及家蠶分子改良研究提供指導(dǎo)。

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