副溶血弧菌檢測方法研究

摘要：副溶血弧菌是一種廣泛存在于水生環境中的致病性較強的細菌， 嚴重危害人和動物健康， 對其進行快速檢測研究具有重要的理論和現實意義。本文綜述了2016-2018年以來副溶血弧菌在分子生物學、免疫學和電化學等方面的最新檢測方法研究進展，旨在為副溶血弧菌的快速檢測研究提供參考和理論依據。

關鍵詞：副溶血弧菌；檢測方法；免疫檢測；電化學檢測

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus， VP）是屬于弧菌屬的一種具有強致病性病的革蘭氏陰性細菌，該細菌嗜鹽，往往會寄生在河流或海洋環境中的一些浮游生物和水體污染物上。近年來，與副溶血弧菌相關的臨床病例檢測報告時有報道，而且在世界各地都有過大規模的流行。因此，副溶血弧菌早期檢測方法的建立對于預防好控制該菌引起的疾病尤為重要。本文綜述了自2016-2018年以來副溶血弧菌在分子生物學、免疫學和電化學等方面的最新檢測方法研究進展，旨在為副溶血弧菌的快速檢測研究提供參考和理論依據。

1、基于PCR的檢測方法

1.1 常規PCR方法

PCR技術是上世紀后期發展起來的熱門分子生物學技術之一，該技術已被廣泛應用于食品、農業和微生物等領域的快速診斷。目前，基于各種形式的PCR檢測技術已用于副溶血弧菌的快速檢測。Li等[1]在2016年開發了一種新的PCR技術用于副溶血弧菌的快速、準確檢測，該方法以副溶血弧菌的內源性β-內酰胺酶基因blaCARB-17為檢測靶標。該基因比傳統的tlh，toxR和atpA靶標基因更加保守，檢測該菌的特異性達100%。Alaboudi等[2]以副溶血弧菌的gyrB和toxR等基因為靶標，利用PCR技術實現了約旦海岸線的致病性VP的檢測與鑒定。Yang等[3]建立了一種新的RPA-IAC的PCR擴增技術，該方法使用重組聚合酶并結合一個內源性擴增對照，在37℃的條件下20 min即可完成擴增，其檢測靈敏度可達3×103CFU/mL。

1.2 實時定量PCR方法

實時定量PCR是在PCR過程中加入熒光染料，通過熒光分子信號監測整個PCR進程，并對擴增的靶標進行準確定量分析。Niu等[4]研制了一種實時熒光定量PCR技術，以Vp菌的UreR為檢測靶基因，在擴增體系中加入疊氮溴化丙錠抑制死細胞DNA擴增，被應用于同時檢測和定量活的致病性和非致病性Vp菌株。Xu等[5]建立一種多重實時定量PCR方法，以groEL， tdh和trh檢測模板，實現Vp菌的快速檢測與鑒定，該方法的最低檢測值為104 CFU/mL。

1.3 PCR整合技術方法

近3年來，越來越多的PCR與其他檢測技術相結合，被廣泛用于Vp菌的檢測分析，具體報道如下。Cheng等[6]利用比色法整合PCR，以tdh，trh，tlh和toxR等毒力基因為檢測靶標快速檢測Vp菌。Lun等[7]建立了一種基于PCR與免疫磁珠分離現結合的方法檢測Vp菌及急性肝壞死疾病（AHPND），該方法的最低檢測線為CFU/mL。Machado和Bordalo[8]通過最大可能性PCR（MPN-PCR）同時檢測和分析西非幾內亞比紹海岸水環境中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌分布，致病性副溶血弧菌的檢測豐度為1.2×103 MPN/L。Wang等[9]建立了一種基于納米金顆粒多重寡核苷酸PCR與生物芯片雜交方法實現同時檢測8種食源性致病細菌（含副溶血弧菌），該檢測方法的靈敏度為3.3～85 CFU/mL。

1.4 環介導等溫擴增方法

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification， LMAP）是一種在恒溫條件下快速擴增核酸的基因診斷技術，由于其獨特的擴增方式，已被用于各種致病性微生物的快速檢測診斷。Shiddique等[10]以副溶血弧菌的高度保守型groEL基因為檢測靶標，利用LMAP技術實現副溶血弧菌的檢測，其最低檢測線為100 fg/每個反應，檢測靈敏度比常規PCR要高100倍，在模擬海產品和海水中，最低檢測線分別為120 fg和150 fg/每個反應。Pang等[11]設計了一種方法在微流控芯片上利用多色LMAP擴增技術實現副溶血弧菌的定量快速檢測，在污染的食品中和細菌沒有預富集條件下該方法的最低檢測閾值為1×103 CFU/mL。Wang等[12]建立了基于多重限制性內切酶實時環介導的等溫擴增技術（Multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology，MERT-LAMP），該方法以副溶血弧菌的toxR和創傷弧菌的rpoS基因為檢測靶標，其檢測的靈敏度好，是普通PCR和qPCR的100倍以上，在模擬樣品中的針對副溶血弧菌的檢測閾值為92 CFU/mL。Liu等[13]建立了一種多重環介導等溫擴增方法在同一個反應內同時檢測和區分沙門氏菌和副溶血弧菌。該方法展示了100%的包容性和排他性，并具有和多重PCR相似的檢測閾值。Zhong等[14]以副溶血弧菌tlh，tdh和trh為靶標，設計了6條引物，通過PMA-LMAP等溫擴增技術檢測并區分處于活的但不可培養狀態（Viable but Non-Culturable， VBNC）和死的狀態的副溶血弧菌。

2、基于免疫學的檢測方法

免疫分析法是建立在抗原抗體特異性結合反應基礎上的一種新的檢測技術，可以用各種微生物、蛋白質和小分子物質的快速檢測分析。Liu等[15]建立了一種高度靈敏的膠體金檢測方法，實現了副溶血弧菌的快速檢測。該方法特異性強，其檢測閾值為1.2×103 CFU/mL。Park和Choi[16]設計了一種基于液相芯片的免疫分析法，可以在45 min內完成對副溶血弧菌進行快速靈敏檢測，檢測閾值范圍為101～105 CFU。Liu等[17]利用具有辣根過氧化物酶活性的MnO2納米顆粒標記的特異性9肽建立了一種靈敏的比色免疫測定方法，該方法具有較寬的檢測范圍為20～104 CFU/mL，最低檢測線為15 CFU/mL。Fu等[18]建立了一種基于Mn2+介導組裝納米金顆粒的比色免疫分析方法，可以在不富集的條件對海產品中的副溶血弧菌進行快速檢測。分析結果中紅-紫-藍顏色的變化反映了不同濃度的副溶血弧菌（10～106 CFU/mL），最低檢測線為10 CFU/mL。

3、基于電化學的檢測方法

電化學生物傳感器是近年來發展起來的一門新型檢測技術，由于其良好的敏感性與選擇性，在生物檢測領域中被廣泛應用。Nordin等[19]研發了一種電化學生物傳感器，以聚乳酸化金顆粒標記碳電極為檢測端，而亞甲藍試劑作為指示劑，用于檢測貝類動物中副溶血弧菌。建立的傳感器能夠特異地區分完整的、不完整的和錯配的寡核苷酸片段，DNA分子的檢測范圍為2.0×108～2.0×1013 M，最低檢測線為2.16 pM。Nordin等[20]于2018年建立了一種電化學DNA生物傳感器，用于檢測食源致病性副溶血弧菌，該生物傳感器體現了良好的特異性和檢測應用范圍。

4、其他類型檢測方法

除了PCR、免疫學和電化學方法以外，也有相關的其他方法被報道用于檢測或區分不同類型和狀態的副溶血弧菌。Yeung和Thorsen[21]設計并研發了一種新配方的產色瓊脂培養基，利用不同弧菌在培養基上的產色差異，可以更加直觀和特異的檢測和區分副溶血弧菌與其他類型弧菌。該方法是多年來僅有的細菌培養檢測文獻報道，為弧菌的生化鑒定提供了有利的方法，補充現有生化分析方法的不足。Liu等[22]建立了一種基于CdSe/ZnS量子點與納米金之間電荷轉移的選擇性熒光“開關”的副溶血弧菌檢測方法，該方法將IgY抗體與金顆粒偶聯，借助于量子點與金納米顆粒之間的電荷轉移，從而有效介導熒光信號的“開”與“關”，根據熒光型號的選擇性轉換，實現副溶血弧菌的快速檢測。Yao等[23]設計了一種新型光譜與核酸相結合的技術，在體外利用等溫核酸擴增增強物質表面拉曼光譜信號，實現副溶血弧菌的超靈敏檢測。該方法的最低檢測線為1 CFU/mL，在模擬樣品的測試中體現出比較滿意的特異性和檢測靈敏度。

5、結語與展望

綜觀以上副溶血弧菌的檢測方法，近3年的檢測方法中基于PCR的檢測仍占據主導地位，而其他方法發展較為迅速，尤其以基于免疫學和電化學方法的新型檢測技術不斷涌現，在副溶血弧菌檢測中發揮越來越重要的作用。隨著科學技術的不斷發展和副溶血弧菌檢測的要求，未來仍然需求多元檢測技術的創新與整合，以求開發特異性性更強，檢測靈敏度更高和適應性更好的檢測新技術，從而真正實現副溶血弧菌快速、高效的靈敏的檢測與監測，保障海產品安全與生命健康。

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通訊作者：汪世華，男，博士，教授，研究方向： 微生物免疫檢測。

基金項目：福建省海洋高新產業發展專項項目（閩海洋高新[2015]26號）。